İlgilenilen genlerde floksed aleller taşıyan normal fare ürotelyal hücrelerinin ex vivo gen düzenlemesi yoluyla mesane kanseri organoidleri üretmek için hızlı ve etkili bir protokol geliştirdik. Bu ex vivo yöntem, yıllarca fare yetiştiriciliği yerine bir ila iki haftalık bir iş akışına sahiptir ve Cre-mediated gen delesyonlarında adenovirüs transdüksiyonunda oldukça etkilidir. Başlamak için, makas, forseps, DPBS dahil olmak üzere tüm steril aletleri ve reaktifleri 35 mililitrelik kültür tabaklarında,% 70 etanol, gazlı bez ve temiz kağıt havlularda hazırlayın.
Ardından, diseksiyon alanının tüm yüzeylerini temizleyin ve diseksiyon alanını temiz bir kağıt havlu ile örtün. Ötenazi fareyi diseksiyon bölgesindeki gazlı bezin üzerine yerleştirin ve farenin karnına% 70 etanol püskürtün, ardından steril diseksiyon makası kullanarak, mesaneyi açığa çıkarmak için daha düşük bir orta hat karın kesisi yapın. Şimdi, forsepsleri kullanarak iki taraflı üreterovezik kavşağı tanımlamak için mesaneyi yavaşça yukarı çekin.
Makas kullanarak, iki üreter açıklığı arasındaki sınır çizgisini izleyerek mesane fundusunu çıkarın ve mesaneyi 2 mililitre DPBS içeren steril bir kaba aktarın, ardından yağ ve bağ dokusunu çıkarın ve mesaneyi 2 mililitre DPBS içeren yeni bir kaba koyun. Ayrıca adenovirüsü eksi 80 santigrat derece depodan çıkarın ve buz üzerinde tutun. Hücre ayrışması için, tüm steril aletleri ve reaktifleri makalede açıklandığı gibi hazırlayın, daha sonra bir biyogüvenlik kabininde, mesaneyi 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve 2 mililitre steril DPBS ile yıkayın.
Mesane dokularını dört fareden odun kömürü soyulmuş FBS olmadan bir mililitre tam kültür ortamına sahip bir kaba toplayın. Daha sonra, cerrahi bir bıçak kullanarak, her bir mesaneyi dört eşit parçaya bölün, ardından forseps kullanarak, ürotelyum yüzeyini ortama maruz bırakmak için mesaneyi açın. Mesane parçalarını ve ortamını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Çanağı, kömürden arındırılmış FBS olmadan 2 mililitre tam kültür ortamı ile iki kez yıkayın ve yıkamayı santrifüj tüpüne ekleyerek toplam hacmi 5 mililitreye getirin. Daha sonra, bir kollajenaz ve hyaluronidaz karışımı ekleyin ve tüpü yatay olarak 200 RPM'de 30 dakika boyunca 37 derecelik bir santigrat derece orbital çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Doku sindiriminden sonra, tüpe eşit hacimde% 10 odun kömürü soyulmuş FBS ve DPBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletine 2 mililitre tripsin ikamesi ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpü 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 4 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücreleri standart bir P1000 ucuyla 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve 5 mililitre% 10 odun kömürü soyulmuş FBS ve DPBS ekleyin. Ayrışmış hücreleri 100 mikrometrelik steril bir hücre süzgeci ile süzün ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti 1 mililitre tam kültür ortamında yeniden askıya alın. Bir hemositometre ve plaka kullanarak hücre sayısını 0,5 mililitre taze tam kültür ortamı içeren 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 6. hücrelere 0,5 çarpı 10 olarak sayın.
Daha sonra, eksi 20 santigrat derece depolamadan Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücrelerinin matris özlerini çıkarın ve buz üzerinde çözün. Ayrıca, 37 derecelik bir santigrat hücre inkübatöründe 6 kuyucuklu bir plakayı önceden ısıtın. Adenoviral transdüksiyon için, 24 delikli plakaya 2 mikrolitre adenovirüs ekleyin ve ayrışmış ürotelyal hücrelerle iyice karıştırın.
Transdüksiyon etkinliğini arttırmak için, plakayı 30 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj ederek spinokülasyon yapın, ardından plakayı 1 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücreleri ve ortamı kuyudan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, 50 mikrolitre tam kültür ortamı ekleyin ve alttaki hücrelerle iyice karıştırın.
Daha sonra, 140 mikrolitre matris özü ekleyin ve hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça iyice karıştırın, ardından önceden ısıtılmış 6 delikli plakaya kubbe başına 50 mikrolitre çözelti ekleyerek organoidler için kubbeler oluşturun. Plakayı inkübe edin ve kubbelerin 5 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. 5 dakika sonra, 6 delikli plakayı baş aşağı çevirin ve 25 dakika daha katılaşmaya devam edin.
Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa 2,5 mililitre tam kültür ortamı ekleyin ve plakayı organoid kültür için bir inkübatöre yerleştirin. Yeşil floresan protein, hücrelerin yaklaşık% 100'ünde tespit edildi ve bu da adenovirüs transdüksiyonunun yüksek verimliliğini düşündürdü. Üçlü nakavt organoid tümörlerinin hematoksilin ve eozin boyama ve immünohistokimyası, CK5 ve p63'ün bazal alt tip belirteçlerinin pozitif protein ekspresyonu ile yüksek dereceli ürotelyal karsinomun morfolojisini gösterdi.
Rekombine edilmemiş floksed aleller, adenovirüs ile tedavi edilmemiş ürotelyal hücrelerde tespit edilirken, rekombine aleller üçlü nakavt organoidlerinde gözlendi. Genel olarak, 2 santimetre subkutan tümör oluşturmak için 2 ila 3 hafta gerekiyordu. Üçlü nakavt organoidlerinin immünohistokimyası, in vivo ksenogreftler, CK7, CK5 ve p63 proteinlerinin pozitif ekspresyonunu gösterdi.
CK8 ve üroplakin proteinleri için negatif ekspresyon tespit edildi. Mezenkim belirteci vimentin, sadece tümör kapsülünde veya stromada tespit edildi. Fare mesane ayrışması 30 dakikayı geçmemelidir.
Endotel hücreleri ve fibroblastlar gibi stroma hücrelerinin yüzdesinde daha uzun bir ayrışma süresi artabilir Bu yaklaşım, bazal organoidlere karşı lümen gibi spesifik organoidlerin hücre tipini üretmek için hücre sıralaması veya hücre tipi spesifik bir adenovirüs ile birleştirilebilir.
