ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לסנן את ההשפעה של אנזימי גליקוזילציה מרובים על פרופיל הגליקו של חלבון מטרה ולתרום להבנה טובה יותר של תפקודי האנזים. אופיו של הפרוטוקול מאפשר הקרנה של אנזימי גליקוזילציה באופן חולף, אך בעל תפוקה גבוהה. פרופילי גליקוזילציה משתנים יכולים להוביל לשיפור בפעילות הנוגדנים, ולכן להגביר את היעילות של המוצר הסופי.
חברות ביו-פרמצבטיות עוקבות מקרוב אחר הגליקוזילציה כתכונת איכות קריטית. גליקוזילציה חריגה היא סימן היכר של מחלות כמו סרטן. לכן, שיטה זו רלוונטית למחקר פרמקולוגי וביו-רפואי.
הפרוטוקול מניח שלמשתמשים יש ניסיון במספר טכניקות ניסיוניות, כולל טרנספקציה של תאי יונקים וכתמים מערביים. עדיף להתחיל עם פחות דגימות ולהשתמש בנקודות עצירה במקרה הראשון. התחל בהערכת הצפיפות והכדאיות של תאי השחלה של האוגר הסיני.
לאחר מכן, נקו בזהירות את ארון הבטיחות הביולוגית ואת כל הציוד עם 70% אתנול ותמיסת מעכבי RNase כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, מטילים את התאים ב-100 פעמים G במשך חמש דקות ומחזירים אותם לתווך שחומם מראש בצפיפות תאים של חמישה פעמים 10 עד ששת התאים למיליליטר. העברת שמונה מיקרוליטרים של תערובת או בקרה של מאסטר DsiRNA לקובט אלקטרופורציה סטרילית.
הוסיפו 800 מיקרוליטרים של תרחיף התא לאותה קובט, ערבבו והעבירו את פולס האלקטרופורציה. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא מהקובטה לבאר אחת של צלחת בעלת שש בארות, תוך הימנעות מחומר דמוי קצף. דגירה של התאים במשך 10 דקות מבלי לרעוד.
לאחר הדגירה, הוסיפו 800 מיקרוליטרים של מדיה שחוממה מראש כדי ליצור נפח סופי של 1.6 מיליליטר לבאר. לגדל את התאים שעברו טרנספקציה באינקובטור תוך כדי רעד ב-150 סל"ד. לאחר 48 שעות, לקצור את supernatant ואת התאים.
לאחר טיהור IgG, הוסיפו אלוטיון A על רכז צנטריפוגלי לניתוק משקל מולקולרי של שלושה קילודלטון, וצנטריפוגה ב-13, 300 פעמים G למשך 40 עד 50 דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה הושלמה ברגע שהנפח השיורי שווה או קטן מ-50 מיקרוליטרים. השליכו את הזרימה והוסיפו 500 מיקרוליטרים של PBS 1X מצונן מראש כדי לדלל את שאריות הסופרנאטנט.
צנטריפוגה של הדגימה שוב באמצעות אותם תנאים עד שיישארו 50 מיקרוליטרים של שאריות סופרנאטנט. כדי להשיג דילול של פי 100 של הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של PBS 1X מצונן מראש וחזור על תהליך הצנטריפוגה. מרכזים את הסופרנטנט לריכוז סופי של כ-2.5 גרם לליטר ב-40 מיקרוליטרים כדי להבטיח תאימות לשיטת ניתוח הגליקן.
לצורך ניתוח גליקאן, העבר 200 מיקרוליטרים של תמיסת החרוז המגנטי לצינור PCR של 2 מיליליטר. הניחו אותו על המעמד המגנטי כדי להפריד את החרוזים מהסופרנאטנט והסירו את הסופרנאטנט בזהירות. לאחר מכן, הסר את הצינורות מהמעמד המגנטי והוסף את דגימת החלבון המטוהרת ואת המערבולת.
לאחר מכן, הוסיפו את חיץ הדה-נטורציה של האספקה לצינור הדגימה ודגרו במשך שמונה דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס. שמור על צינורות הדגימה פתוחים לביצועי תגובה אופטימליים. לאחר הדגירה, מוסיפים PNGase F ומדגרים עוד 20 דקות ב-60 מעלות צלזיוס כדי לבקע את הגליקנים מהנוגדנים המטוהרים.
לאחר שחרור N-glycans, לסגור את צינור הדגימה ואת המערבולת. לאחר מכן, הוסיפו אצטוניטריל לצינור הדגימה, למערבולת ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. מקם את צינורות הדגימה במעמד המגנטי כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה, להסיר בזהירות את supernatant מבלי לגעת בחרוזים. הוסיפו את תמיסת תיוג הגליקן המכילה פלואורופור לדגימה במכסה אדים וערבבו על ידי מערבולת. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס עם מכסים פתוחים, יש להסיר את עודפי הצבע על ידי שטיפת הדגימה שלוש פעמים באצטוניטריל.
לאחר מכן, הורידו את הגליקנים המסומנים במים מזוקקים כפולים. מניחים את שפופרת הדגימה במעמד המגנטי ואוספים את הסופרנאטנט המועשר בגליקנים מטוהרים ומסומנים. לאחר מכן, הכן וטען את כל התקנים והדגימות הנדרשים למיקומי המגש המיועדים.
הפעל את פרוטוקול ניתוח הגליקן ותנתח וזיהה את הגליקנים הקיימים בדגימה באמצעות תוכנה מתאימה. ניתוח כתמים מערביים הראה ביטוי מופחת של חלבון Fut8 בתאים שעברו טרנספקציה בתערובת של שלושה מבני Fut8 DsiRNA. גם מבנים של גליקן מתאי ההפלה הראו ירידה בפוקוסילציה.
מגמה זו בלטה בעיקר במבנים אגלאקטוסילים ונצפתה במידה פחותה במבנים גלקטוזיליים. ירידה של פי שניים בפוקוסילציה של הליבה נצפתה מאלקטרופורציה באמצעות שני פולסים של גלים רבועים בהשוואה לפולס גל מרובע יחיד ללא הבדלים משמעותיים בכדאיות התא. באופן כללי, הגדלת ריכוז הרנ"א המתערב קצר יש הפרעה גדולה לפוקוסילציה של הליבה מאשר הגדלת זמן הקציר.
היחס בין מים לאצטוניטריל קובע אם הגליקנים נמצאים בתמיסה או בחלק מהחרוזים. חשוב לזכור זאת במהלך שלבי הכביסה כדי למנוע הסרה מקרית של הגליקנים המסומנים בתמיסה. ניסוי המשך עשוי לכלול אפיון של נוגדנים חד-שבטיים מטוהרים באמצעות מבחנים מבוססי תאים כדי לכמת ציטוטוקסיות של תאים התלויים בנוגדנים וציטוטוקסיות תלוית-השלמה.
