Ce protocole peut être utilisé pour dépister l’effet de plusieurs enzymes de glycosylation sur le profil glyco d’une protéine cible et contribuer à une meilleure compréhension des fonctionnalités de l’enzyme. La nature du protocole permet le criblage des enzymes de glycosylation de manière transitoire, mais à haut débit. Des profils de glycosylation altérés peuvent conduire à une amélioration des activités des anticorps, et donc augmenter l’efficacité du produit final.
Les sociétés biopharmaceutiques surveillent de près la glycosylation en tant qu’attribut de qualité critique. Une glycosylation aberrante est une caractéristique de maladies comme le cancer. Par conséquent, cette méthode est pertinente pour la recherche pharmacologique et biomédicale.
Le protocole suppose que les utilisateurs ont de l’expérience dans plusieurs techniques expérimentales, y compris la transfection de cellules de mammifères et les transferts de Western. Il est préférable de commencer avec moins d’échantillons et d’utiliser des points d’arrêt en premier lieu. Commencez par évaluer la densité et la viabilité des cellules de l’ovaire du hamster chinois.
Ensuite, nettoyez soigneusement l’armoire de biosécurité et tout l’équipement avec de l’éthanol à 70% et une solution d’inhibiteur de RNase pour éviter toute contamination. Ensuite, abattez les cellules à 100 fois G pendant cinq minutes et remettez-les en suspension dans un milieu préchauffé à une densité cellulaire de cinq fois 10 à six cellules par millilitre. Transférer huit microlitres du mélange ou du contrôle maître DsiRNA dans une cuvette d’électroporation stérile.
Ajouter 800 microlitres de la suspension cellulaire à la même cuvette, mélanger et délivrer l’impulsion d’électroporation. Ensuite, transférez la suspension cellulaire de la cuvette à un puits d’une plaque à six puits, en évitant le matériau semblable à de la mousse. Incuber les cellules pendant 10 minutes sans secouer.
Après l’incubation, ajouter 800 microlitres de milieux préchauffés pour obtenir un volume final de 1,6 millilitre par puits. Cultivez les cellules transfectées dans l’incubateur tout en secouant à 150 RPM. Après 48 heures, récoltez le surnageant et les cellules.
Après la purification des IgG, ajouter l’élution A sur un concentrateur centrifuge de coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons et centrifuger à 13 300 fois G pendant 40 à 50 minutes à quatre degrés Celsius. La centrifugation est terminée une fois que le volume résiduel est égal ou inférieur à 50 microlitres. Jeter le flux et ajouter 500 microlitres de PBS 1X pré-réfrigéré pour diluer le surnageant résiduel.
Centrifuger à nouveau l’échantillon en utilisant les mêmes conditions jusqu’à ce qu’il reste 50 microlitres de surnageant résiduel. Pour obtenir une dilution 100X du surnageant, ajoutez 500 microlitres de PBS 1X pré-réfrigéré et répétez le processus de centrifugation. Concentrez le surnageant dans une concentration finale d’environ 2,5 grammes par litre dans 40 microlitres pour assurer la compatibilité avec la méthode d’analyse du glycane.
Pour l’analyse des glycanes, transférer 200 microlitres de la solution de billes magnétiques dans un tube PCR de 2 millilitres. Placez-le sur le support magnétique pour séparer les perles du surnageant et retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, retirez les tubes du support magnétique et ajoutez l’échantillon de protéine purifiée et le vortex.
Ensuite, ajoutez le tampon de dénaturation d’alimentation au tube d’échantillonnage et incubez pendant huit minutes à 60 degrés Celsius. Gardez les tubes d’échantillonnage ouverts pour des performances de réaction optimales. Après l’incubation, ajouter PNGase F et incuber pendant encore 20 minutes à 60 degrés Celsius pour cliver les glycanes des anticorps purifiés.
Après la libération de N-glycanes, fermez le tube d’échantillonnage et le vortex. Ensuite, ajoutez l’acétonitrile au tube d’échantillonnage, au vortex et incubez à température ambiante pendant une minute. Placez les tubes d’échantillonnage dans le support magnétique pour séparer les billes de la solution.
Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirez soigneusement le surnageant sans toucher les perles. Ajouter la solution d’étiquetage du glycane contenant du fluorophore à l’échantillon dans une hotte et mélanger par vortex. Après une incubation de 20 minutes à 60 degrés Celsius avec des couvercles ouverts, enlever l’excès de colorant en lavant l’échantillon trois fois dans de l’acétonitrile.
Ensuite, éluez les glycanes étiquetés dans de l’eau double distillée. Placez le tube d’échantillonnage dans le support magnétique et prélevez le surnageant enrichi en glycanes purifiés et étiquetés. Ensuite, préparez et chargez toutes les normes et tous les échantillons requis dans les positions de plateau désignées.
Exécutez le protocole d’analyse des glycanes et analysez et identifiez les glycanes présents dans l’échantillon à l’aide d’un logiciel approprié. L’analyse par transfert Western a montré une réduction de l’expression de la protéine Fut8 dans les cellules transfectées avec un mélange de trois constructions d’ARNds Fut8. Les structures glycanes des cellules knockdown ont également montré une diminution de la fucosylation.
Cette tendance était plus prononcée dans les structures agalactosylées et observée dans une moindre mesure dans les structures galactosylées. Une réduction de deux fois de la fucosylation du noyau a été observée à partir de l’électroporation en utilisant deux impulsions à ondes carrées par rapport à une seule impulsion à ondes carrées sans différences significatives dans la viabilité cellulaire. Dans l’ensemble, l’augmentation de la concentration d’ARN interférent à court terme a une grande interférence sur la fucosylation du noyau que l’augmentation du temps de récolte.
Le rapport entre l’eau et l’acétonitrile détermine si les glycanes sont en solution ou en partie des perles. C’est crucial de s’en souvenir pendant les étapes de lavage pour éviter le retrait accidentel des glycanes étiquetés de la solution. Une expérience de suivi pourrait impliquer la caractérisation d’anticorps monoclonaux purifiés à l’aide de tests cellulaires pour quantifier la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps et la cytotoxicité dépendante du complément.
