נוגדנים חד שבטיים ידועים כנוגדנים חד-ספציפיים המופקים משבט B-לימפוציטים יחיד ומהנוגדנים המונו-וואלנטיים שנקשרים לאותה אפיטופ. לאחרונה, ELISA מבוסס נוגדנים חד שבטי הפך לפלטפורמה המתעוררת שלנו לניתוח איכותי או כמותי של מזונות או מוצרים טבעיים. שיטה זו היא שיטה מדויקת, רגישה ויעילה ללא שלבי טיפול מקדים מייגעים.
אז זה חיוני עבור דגימות ביולוגיות ואת היישומים הקליניים בעתיד. הכנת mABs של TCM הוא צעד חיוני במחקרים על מאפייני מערכת מורכבים של נוסחת TCM. פיתחנו פרוטוקול ליצירת MABs נגד תרכובות מולקולריות קטנות, כולל סינתזת אנטיגן מלאכותית, חיסון עכברים והיתוך תאים.
ההאפטן מחובר לחלבון המוביל לסנתז את האנטיגן המלאכותי. אנטיגן מלאכותי ודג'ובנטים שלמים מעורבבים ומונעים. העכבר היה מחוסן על ידי זריקה תת עורית.
מוציאים את הטחול של עכבר מחוסן ולעשות השעיה חד-תאית. מערבבים את תאי המיאלומה. Splenocytes מבודדים ומותכים עם קו התא מיאלומה עכבר רגיש כובע על ידי שיטת PEG.
בחר קו תא מסוגל להכין נוגדנים על ידי ELISA. כלאיים מפרישים נוגדנים חד שבטיים שמגיבים לאנטיגן משובפלים. להקים את קו התא היברידית הוא cryopreserved.
הליך חמצון תקופתי שימש לסינתזה של קיסם BSA נריגין. ראשית, נריגין היה מומס בריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר ב 100 microliters של פתרון פרוידאט נתרן מוכן טרי לחמישה מיליליטר של פתרון נריגין. מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך שעה.
שנית, מוסיפים שני מיליליטר של חלבון נושא לתערובת התגובה הנריגין נתרן תקופתי. התאימו את התערובת לתסרון pH 9 והמשיכו להגיב במשך שש עד שמונה שעות. שלישית, האנטיגן המלאכותי טוהר בשיטת הדיאליזה ב-PDS במשך שלושה ימים כדי לטהר את הלמ"ס.
התותב המלא של פרוינד והתודעה המלאה של פרוינד שימשו לחיסון עכברים. לחיסון, מערבבים 50 מיקרוגרם של תמיר עם נפח שווה של התת-תותבת המלאה של פרוינד ומערבבים לחלוטין. ניהול 100 מיקרוגרם של תערובת זו לכל עכבר BALB / c באמצעות הזרקה תת עורית הגבית.
לספק חיסון המאיץ באמצעות הזרקה תת עורית שבועיים לאחר מכן עם אותה כמות של קוסם מעורבב עם תריס שלם. עבור חיסון ראשוני, התותב המלא של פרוינד ואימונוגן שימשו באמצעות הזרקה תת עורית. עבור חיסון המאיץ, התת-עורי של פרוינד והאימונוגן שימשו באמצעות הזרקה תת-עורית.
עבור חיסון השפעה ללא אנדרג'ובנט, רק אימונוגן שימשו באמצעות הזרקה תת עורית או הזרקה תוך-אנדראינאלית. תאי שכבת הזנה מקורם בעיקר בתאי אפיתל בטן או מקרופאג'. RPMI 1640 FBS ו- HAT שימשו להכנת מדיום מסך HAT.
תוסף HAT הומס ב 10 מיליליטר RPMI בינוני, ולאחר מכן הוסיף לתוך 500 מיליליטר RPMI 1640 המכיל 20%FBS. ועכבר ICR היה מעוקר על ידי 75% אלכוהול אתיל במשך חמש דקות. לאחר הסרת הפרווה מהבטן עם מדפים המוסטטיים, לחטא את האזור עם 75% אתנול.
חותכים את העור החיצוני כדי לחשוף את חלל הבטן. להזריק שלושה מיליליטר של RPMI סטרילי 1640 בינוני לתוך הבטן. לאחר מכן לעסות את הבטן כדי לנתק תאים נוספים לתוך הפתרון.
שאף את ההשעיה של התא העוברי לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 10 דקות ב 1, 000g, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים העובריים כדי לקבל השעיה תא יחיד. לאחר הליך זה, ממיסים את התאים באמצעות HAT medium.
לספור את התאים כדי להפוך אותו 100, 000 למיליליטר מחברי התא. העבר את התאים לתוך 96 צלחות תרבות התא היטב. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות, 5% פחמן דו חמצני.
העכבר החיסון שנבחר היה מעוקר על ידי 75% אלכוהול אתיל במשך חמש דקות. אספירט RPMI 1640 בינוני כמו מאגר הכביסה. הסר את רקמת העור והשרירים באמצעות מספריים כדי לחשוף את הטחול.
לבודד את הטחול על ידי פינצטה בזהירות. לאחר מכן לשטוף את הטחול ב RPMI 1640. לבודד את הטחול לחתוך לחתיכות.
לאט לאט הלם בטח הטחול. לאחר מכן הוא טופל עם מדיום RMPI 1640 כדי להמיס את התאים כדי להכין השעיית תא טחול. לאחר מכן, התאים היו מסוננים על ידי 800 מסננת תא רשת.
מסמר את הטחול בזהירות כדי להסיר את הרקמות הגדולות. הימנעות רקמות גדולות להשפיע על היתוך של תאים. היה ההשעיה תא הטחול עם RPMI 1640 בינוני.
ואז ההשעיה התאית נוספה לצינור הצנטריפוגה. לקצור את תאי הטחול על ידי צנטריפוגה ב 1, 000g במשך 10 דקות. ואז להשליך את העל-טבעי.
תאי הטחול היו אמורים להיות בסכום של מיליארד עד 10 מיליארד. מוציאים את תאי המיאלומה המעובדים והמגברים מהאינקובטור ומנערים בעדינות את הבקבוק כדי להשיג השעיית תא. היה ההשעיה עם RPMI פעמיים.
מערבבים את ההשעיה של תאי הטחול ואת תאי המיאלומה. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז. ההקצבה הסופית של תאי טחול לתאי מיאלומה צריכה להיות אחת עד חמש עד אחת עד 10.
צנטריפוגה תערובת התא ולאחר מכן להסיר את על טבעי. מוסיפים מיליליטר אחד של תוסף פוליאתילן גליקול של 50% לתאים ומערבבים בעדינות ב-37 מעלות למשך דקה אחת. עומד במשך 30 שניות, להוסיף שני מיליליטר של RPMI 1640 בינוני דגירה ב 37 מעלות במשך שתי דקות כדי לסיים את התגובה.
מוסיפים לשני מיליליטר RPMI לעוד דקה אחת. לאחר מכן, להוסיף לתוך 10 מיליליטר RPMI 1640. צנטריפוגה ב 800g במשך 10 דקות.
משליכים את העל-טבעי, מוסיפים תטבת HAT וממשיכים לטפח את התאים במשך שבעה ימים ב-37 מעלות 5%פחמן דו-חמצני. לאחר שבעה ימים, על-טבעיים של התאים ב-96 צלחות בארות שאפו לאחר היתוך התאים והתווספו לצלחות ELISA מצופות מראש באנטיגן ציפוי. מעובד ב 37 מעלות במשך שעה אחת, נוגדן משני נוסף ומעובד במשך חצי שעה.
לאחר הוספת 100 מיקרוליטרים של פתרון מצע. תפסיק את התגובה. כדי לוחות ELISA לתוך קורא מיקרופלסטיק, שיטת נקודת הקצה שימש לקרוא את הנתונים ב 450 ננומטר.
ספיגה נמדדת ב 450 ננומטר ולסנן את היברידיות חיוביות. השתמש בשיטת הדילול המגבילה כדי להכין את ההיברידיות המונוקלונאליות. לאחר הסרת מדיום HD מההיברידיות שנבחרו, השהה מחדש את התאים ב- RPMI 1640 וספיר אותם.
לדלל את התאים של ריכוז של תא אחד, שני תאים, וארבעה תאים ל הבאר על ידי RPMI 1640 ב 96 גם צלחת ותרבות. העבר תאים מן hybridomas כי הם חיוביים 24 צלחות גם, 25 ו 75 flasks סנטימטר מרובע לטיפוח. לאחסן את myodomas בתיבת קירור הדרגתית במינוס 80 מעלות במשך 24 שעות.
לאחר מכן מעבירים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. טיטר של אנטישמיות נקבעו על ידי ELISA עקיף. עכבר אחד עד ארבעה היה מחוסן עם נריגין BSA משותף היה גבוה באופן משמעותי מאשר עכבר הבקרה ללא חיסון.
הטיטר של 1 עד 5, 000 הוא דיפוזיה. המשקל המולקולרי של ההאפטן תותב אושר על ידי ניתוח MALDI-TOF. כפי שמוצג איור 2, כמשקל מולקולרי של תקן BSA ונריגין ידועים, אנו יכולים לחשב ולקבוע כי המולקולות של נריגין היו משותף עם BSA.
רק ההיברידית יכולה לשרוד ולצמוח במדיה לבחירת HAT. לאחר שבעה ימים של צמיחה, תרבות התאים יכולה להיבדק על ידי ELISA. ההיברידיות החיוביות שכפלו והתרחבו מחדש.
תמונות אלה מראות את התוצאה הקונבנציונלית עבור קווי תאים היברידיים חד-תאיים ופוליקלונליים יציבים. הנקודה הקריטית של ניסוי זה היא סינון mAbs ספציפי עבור hapten, אבל לא חלבון נושא. הספציפיות של mAb נבדקו אז בנוכחות תרכובות אחרות הקשורות מבנית.
תגובתיות הצלב חושבה כדי להעריך את הספציפיות mAb לאנטיגן. עקומת הכיול של קרינגין וטווח אניה הושגו. ההיברידיות המונוקלונאליות הספציפיות לאנטיגן הורחבו והוקפאו בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שיש לך הבנה טובה כיצד ליצור נוגדנים חד שבטיים נגד תרכובות מולקולריות קטנות. אז זה הכל. תודה על הצפייה שלך ובהצלחה על הניסויים שלך.
