Этот протокол может быть использован для скрининга влияния нескольких ферментов гликозилирования на глико-профиль белка-мишени и способствовать лучшему пониманию функциональных возможностей фермента. Характер протокола позволяет проводить скрининг ферментов гликозилирования переходным, но высокопроизводительным способом. Измененные профили гликозилирования могут привести к улучшению активности антител и, следовательно, к повышению эффективности конечного продукта.
Биофармацевтические компании внимательно следят за гликозилированием как критическим атрибутом качества. Аберрантное гликозилирование является отличительной чертой таких заболеваний, как рак. Поэтому данный метод актуален для фармакологических и биомедицинских исследований.
Протокол предполагает, что пользователи имеют опыт работы с несколькими экспериментальными методами, включая трансфекцию клеток млекопитающих и вестерн-блоты. Лучше начать с меньшего количества образцов и использовать остановочные точки в первую очередь. Начните с оценки плотности и жизнеспособности клеток яичников китайского хомяка.
Затем тщательно очистите шкаф биобезопасности и все оборудование 70% этанолом и раствором ингибитора РНКазы, чтобы избежать загрязнения. Затем гранулируют клетки в 100 раз G в течение пяти минут и повторно суспендируют их в предварительно нагретой среде при плотности клеток от пяти раз 10 до шести клеток на миллилитр. Переведите восемь микролитров главной смеси или управления DsiRNA в стерильную электропорационную кювету.
Добавьте 800 микролитров клеточной суспензии в ту же кювету, перемешайте и подайте импульс электропорации. Затем перенесите клеточную суспензию из кюветы в одну лунку из шестилуночной пластины, избегая пеноподобного материала. Инкубировать клетки в течение 10 минут без встряхивания.
После инкубации добавьте 800 микролитров предварительно нагретой среды, чтобы получить конечный объем 1,6 миллилитра на лунку. Выращивайте трансфектированные клетки в инкубаторе, встряхивая при 150 оборотах в минуту. Через 48 часов собирают супернатант и клетки.
После очистки IgG добавьте элюирование A на центробежный концентратор с отсечкой молекулярной массы с тремя килодальтонами и центрифугу в 13, 300 раз G в течение 40-50 минут при четырех градусах Цельсия. Центрифугирование завершается после того, как остаточный объем равен или меньше 50 микролитров. Отбросьте сквозной поток и добавьте 500 микролитров предварительно охлажденного 1X PBS, чтобы разбавить остаточный супернатант.
Центрифугирование образца снова с использованием тех же условий до тех пор, пока не останется 50 микролитров остаточного супернатанта. Чтобы получить 100-кратное разбавление супернатанта, добавьте 500 микролитров предварительно охлажденного 1X PBS и повторите процесс центрифугирования. Сконцентрируйте супернатант в конечной концентрации приблизительно 2,5 грамма на литр в 40 микролитрах для обеспечения совместимости с методом анализа гликана.
Для анализа гликана переложите 200 микролитров раствора магнитного шарика в 2-миллилитровую ПЦР-трубку. Поместите его на магнитную подставку, чтобы отделить бусины от супернатанта и осторожно удалите супернатант. Затем снимите трубки с магнитного стенда и добавьте очищенный образец белка и вихрь.
Затем добавьте буфер денатурации в пробирку и инкубируйте в течение восьми минут при температуре 60 градусов Цельсия. Держите пробки открытыми для оптимальной эффективности реакции. После инкубации добавьте PNGase F и инкубируйте еще 20 минут при 60 градусах Цельсия, чтобы отделить гликаны от очищенных антител.
После высвобождения N-гликанов закройте пробу и вихрь. Затем добавьте ацетонитрил в пробирку, вихрь и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты. Поместите пробирки для образцов в магнитную подставку, чтобы отделить шарики от раствора.
Затем, используя пипетку, аккуратно удалите супернатант, не касаясь бусин. Добавьте флуорофорсодержащий раствор для маркировки гликана к образцу в вытяжной вытяжке и перемешайте путем вихря. После 20-минутной инкубации при температуре 60 градусов Цельсия с открытыми крышками удалите лишний краситель, промыв образец три раза в ацетонитриле.
Затем элюируйте меченые гликаны в дважды дистиллированной воде. Поместите пробирку в магнитный стенд и соберите супернатант, обогащенный очищенными и мечеными гликанами. Затем подготовьте и загрузите все необходимые стандарты и образцы в назначенные положения лотка.
Запустите протокол анализа гликана и проанализируйте и идентифицируйте гликаны, присутствующие в образце, с помощью соответствующего программного обеспечения. Анализ вестерн-блоттинга показал снижение экспрессии белка Fut8 в клетках, трансфектированных смесью трех конструкций Fut8 DsiRNA. Гликановые структуры из нокдаун-клеток также показали снижение фукозилирования.
Эта тенденция была наиболее выражена в агалактозилированных структурах и наблюдалась в меньшей степени в галактозилированных структурах. Двукратное снижение фукозилирования ядра наблюдалось при электропорации с использованием двух импульсов квадратной волны по сравнению с одним импульсом квадратной волны без существенных различий в жизнеспособности клеток. В целом, увеличение концентрации короткоинтерферирующей РНК оказывает большое вмешательство в фукозилирование ядра, чем увеличение времени сбора.
Соотношение между водой и ацетонитрилом определяет, находятся ли гликаны в растворе или в составе шариков. Это важно помнить во время этапов стирки, чтобы избежать случайного удаления меченых гликанов из раствора. Последующий эксперимент может включать характеристику очищенных моноклональных антител с использованием клеточных анализов для количественной оценки антителозависимой клеточной цитотоксичности и комплементазависимой цитотоксичности.
