מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות in vivo

אנו מתארים טכניקות הדרושות למודל השתלת העור של xenograft אנושי, כלי חשוב למניפולציה של מסלולים חיסוניים ולא חיסוניים ברקמות אנושיות in vivo. טכניקה זו משחזרת טוב יותר את הפיזיולוגיה של העור האנושי מאשר שיטות במבחנה, ומאפשרת מניפולציה ניסיונית פרה-קלינית in vivo. השתלות עור של Xenograft יכולות לשמש לבדיקות פרה-קליניות של תרכובות המכוונות לדלקת עור אנושית in vivo.

חבישת עכברים יכולה להיות מאתגרת במיוחד, ולכן אנו ממליצים לתרגל את תהליך החבישה על עכברים מורדמים בריאים לפני ביצוע ניתוחים. כדי להתחיל, התכוננו לדרמטומט של דגימת העור האנושית בברדס תרבית רקמה בלחץ שלילי מעוקר על לוח דיסקציה מעוקר. הניחו את דגימת העור עם צד האפידרמיס כלפי מעלה על לוח הנתיחה ונגבו את האפידרמיס עם כרית הכנה סטרילית לאלכוהול ואחריה PBS.

כעת השתמש בסיכת T עם חיתוך של 1.5 אינץ' כדי לתקן את הקצה הקרוב יותר של העור. לאחר מכן דרמטום דגימת העור בעובי 400 מיקרומטר והפעלת לחץ יציב תוך כדי חיתוך קדימה בזווית של 30 עד 45 מעלות. מניחים גזה סטרילית ספוגה ב-PBS סטרילי בתחתית צלחת הפטרי ומניחים את העור עם צד האפידרמיס למעלה על הגזה הרטובה.

יש לאטום ולכסות את שולי הצלחת בסרט איטום שקוף למחצה כדי לוודא שהדגימה אינה מזוהמת ולאחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס לפני ההשתלה. הכינו את המכשירים הסטריליים ואת התחנה הכירורגית להשתלה והשתמשו במגבות נייר אוטומטיות כמשטחים סטריליים למיקום המכשיר והעכבר. לאחר אינדוקציה הרדמה, להעביר את העכבר כרית חימום או מקור חום אחר ולתת את משחת העיניים על ידי טפיחה טיפה קטנה של משחה על העין עם אצבע כפפות.

צובטים את העור ומזריקים משככי כאבים תת עוריים בזווית מקבילה לגוף. לאחר הרמת העכבר על ידי הזנב, לחשוף את הבטן ולהזריק 100 מיקרוגרם לכל 100 microliters של anti-Gr1 intraperitoneally בזווית של 30 מעלות באמצעות מזרק אינסולין מיליליטר אחד. לאחר מכן השתמש בקוצץ חשמלי בטוח לבעלי חיים כדי לגלח את החלקים האמצעיים והעליונים של הצד הגבי של העכבר.

לאחר ניקוי כל השערות, יש למרוח כמות נדיבה של משחה להסרת שיער על העור המגולח. המתן 30 שניות עד דקה, ולאחר מכן נגב את משחת הסרת השיער לחלוטין עם מגבת נייר ו- PBS. לאחר העברת העכבר לתחנת הניתוח, לעקר את אזור הניתוח ולהניח ניילון נצמד סטרילי על העכבר.

חותכים חלון בפלסטיק מעט גדול יותר מגודל השטח המיועד להשתלה. החזיקו את עור התורם במקומו בחוזקה עם הישבן של המלקחיים וחתכו מלבן בצורת 10 על 10 מילימטר של עור התורם כדי להשתיל אותו לצד המלקחיים עם אזמל. משכו את העור הרחק מהגוף כדי למנוע חיתוך עמוק לתוך החיתולית.

כדי ליצור מיטת השתלה, גזור אזור מלבני של עור העכבר התואם את גודל העור התורם. לאחר מכן הניחו את פיסת העור של התורם עם צד האפידרמיס כלפי מעלה על מיטת השתל המוכנה. באמצעות החלק האחורי של המלקחיים, תמרן את העור מחליק קדימה ואחורה עד שהעור התורם שוכב שטוח לחלוטין על מצע השתל.

הוסיפו טיפות דבק לרקמת דבק כירורגית במקום בו עור התורם פוגש את עור העכבר והחזיקו את עור העכבר והתורם יחד עם מלקחיים למשך שנייה עד שתיים, כך שהדבק יידבק לרקמות. יש לאטום לחלוטין את קצה השתל ולאפשר לדבק להתייבש היטב. לאחר מכן, לחתוך גזה פטרולאטום גדול מספיק כדי לכסות את שטח השתל לחלוטין.

מכסים את השתל עם גזה פטרולאטום ולחץ קלות את הגזה על העור באמצעות מלקחיים. חותכים רצועה של סרט שקוף לאורכו כך שהרוחב גדול מספיק כדי לכסות את הפצע של העכבר. לחץ בחוזקה על הלבשת הסרט השקוף עם צד הדבק כלפי מטה מעל הגזה.

גלגלו במהירות את העכבר כדי לעטוף את ההלבשה כולה סביב פלג הגוף העליון, כדי להבטיח שהיא תתאים היטב מבלי לפגוע בנשימה וכל הגפיים יהיו חופשיות לתנועה. לאחר הנחת העכבר בכלוב שחזור, עקוב אחריו עד שהוא ערני ומסתובב. יש לספק מקור חום בחלק של הכלוב למשך 15 דקות לפחות לאחר ההתאוששות.

ניתוח השתלים 10 עד 21 ימים לאחר ההשתלה הראה כי השתל נשאר דבק סביב הקצוות שבהם עור התורם פוגש את עור העכבר והשתל נשאר עבה יותר ודלקתי יותר מעור אנושי בריא. ניתוח על ידי ציטומטריה של זרימה גילה נוכחות מתמשכת של תאי חיסון אנושיים בתוך רוב השתלים, אך הספירה השתנתה בין קסנוגרפטים. השתל המוצלח שמר על תאי החיסון האנושיים.

עם זאת, למרות המשך ההקפדה וההישרדות של רקמת התורם, שתלים שלא הצליחו לשמור על תאי החיסון האנושיים נחשבים ללא מוצלחים. ניתוח של מקטעים מוכתמים של המטוקסילין ואאוזין של השתל לאחר 35 יום הראה אפידרמיס שלם והדרמיס הוא תאי בינוני המורכב מפיברובלסטים סגלגלים שמנמנים עם ציטופלסמה סינסיטיאלית חיוורת ולימפוציטים מפוזרים. ניתוח של השתל לאחר 50 יום הראה תוצאות דומות עם אפידרמיס שלם והדרמיס המכיל פיברובלסטים סגלגלים ותצהיר מטריצה חוץ-תאית משופר מעט.

קסנוגרפטים מוצלחים של העור מסתמכים על הכנה מתאימה של דגימות עור, דיכוי תגובות חיסוניות נויטרופיליות של עכברים על ידי מתן אנטי-Gr1, הקפדה על שיטות ניתוח מכרסמים אספטיים וחבישה מאובטחת של עכברים. מודל השתלת העור של קסנוגרפט אנושי מאפשר לחוקרים לחקור תגובות חיסוניות אנושיות באיבר השלם in vivo, ומספק אפיק חדש למחקר תרגומי.