Delineamos técnicas necessárias para o modelo de transplante de pele de xenoenxerto humano, uma importante ferramenta para a manipulação de vias imunes e não imunes em tecidos humanos in vivo. Esta técnica recapitula melhor a fisiologia da pele humana do que os métodos in vitro, permitindo a manipulação experimental pré-clínica in vivo. Os transplantes de pele de xenoenxerto podem ser usados para testes pré-clínicos de compostos que visam a inflamação da pele humana in vivo.
Ratos de curativo podem ser particularmente desafiadores, por isso aconselhamos a prática do processo de curativo em camundongos anestesiados saudáveis antes de realizar cirurgias. Para começar, prepare-se para dermátomo da amostra de pele humana em um capuz de cultura de tecido de pressão negativa esterilizado em uma placa de dissecção esterilizada. Coloque a amostra de pele com o lado da epiderme para cima na placa de dissecção e limpe a epiderme com uma almofada de preparação de álcool estéril seguida de PBS.
Agora use um pino T dissecante de 1,5 polegadas para fixar a borda mais próxima da pele. Em seguida, dermame-se a amostra de pele a 400 micrômetros de espessura e aplique pressão constante enquanto corta para a frente em um ângulo de 30 a 45 graus. Coloque uma gaze estéril embebida em PBS estéril na parte inferior da placa de Petri e coloque a pele com o lado da epiderme para cima na gaze molhada.
Selar e cobrir as bordas da placa com uma película de vedação semitransparente para garantir que a amostra não esteja contaminada e armazenar a amostra a quatro graus Celsius antes da enxertia. Prepare os instrumentos estéreis e a estação cirúrgica para enxerto e use toalhas de papel autoclavadas como superfícies estéreis para a colocação de instrumentos e camundongos. Após a indução da anestesia, transfira o mouse para uma almofada de aquecimento ou outra fonte de calor e administre a pomada oftálmica passando uma pequena gota de pomada no olho com um dedo enluvado.
Aperte a pele e injete analgésicos por via subcutânea em um ângulo paralelo ao corpo. Depois de levantar o rato pela cauda, exponha o abdómen e injete 100 microgramas por 100 microlitros de anti-Gr1 por via intraperitoneal num ângulo de 30 graus utilizando uma seringa de insulina de um mililitro. Em seguida, use cortadores elétricos seguros para animais para raspar as porções média e superior do lado dorsal do rato.
Depois de limpar todos os pelos, aplique uma quantidade generosa de pomada de depilação na pele raspada. Aguarde 30 segundos a um minuto, em seguida, limpe a pomada de depilação completamente com uma toalha de papel e PBS. Depois de transferir o rato para a estação cirúrgica, esterilize a área cirúrgica e coloque um filme plástico estéril sobre o rato.
Corte uma janela no plástico um pouco maior do que o tamanho da área a ser enxertada. Mantenha a pele do doador firmemente no lugar com a parte traseira do fórceps e corte um retângulo em forma de porção de 10 por 10 milímetros da pele do doador a ser enxertada ao lado do fórceps com um bisturi. Puxe a pele para longe do corpo para evitar cortar profundamente a fáscia.
Para criar um leito de enxerto, corte uma área retangular da pele do rato que corresponda ao tamanho da peça de pele do doador. Em seguida, coloque a peça de pele do doador com o lado da epiderme no leito de enxerto preparado. Usando a parte de trás do fórceps, manipule a pele deslizando para frente e para trás até que a pele do doador fique completamente plana contra o leito do enxerto.
Adicione gotas de adesivo de tecido de cola cirúrgica onde a pele do doador encontra a pele do rato e segure a pele do rato e do dador juntamente com pinças durante um a dois segundos para que a cola adera aos tecidos. Selar completamente a borda do enxerto e deixar a cola secar completamente. Em seguida, corte a gaze de petrolato grande o suficiente para cobrir completamente a área do enxerto.
Cubra o enxerto com a gaze de petrolato e pressione levemente a gaze contra a pele usando fórceps. Corte uma tira de um curativo de filme transparente longitudinalmente para que a largura seja grande o suficiente para cobrir a ferida do mouse. Pressione firmemente o curativo de filme transparente com o lado adesivo para baixo sobre a gaze.
Enrole rapidamente o mouse para envolver o curativo completamente ao redor do tronco, garantindo que ele se encaixe firmemente sem impedir a respiração e que todos os membros estejam livres para o movimento. Depois de colocar o mouse em uma gaiola de recuperação, monitore-o até que esteja alerta e se movendo. Forneça uma fonte de calor por parte da gaiola por pelo menos 15 minutos após a recuperação.
A análise dos enxertos 10 a 21 dias após o transplante mostrou que o enxerto permaneceu aderente ao redor das bordas onde a pele do doador encontra a pele do rato e o enxerto permaneceu mais espesso e mais inflamado do que a pele humana saudável. A análise por citometria de fluxo revelou a presença sustentada de células imunes humanas na maioria dos enxertos, mas as contagens variaram entre os xenoenxertos. O enxerto bem sucedido manteve as células imunes humanas.
No entanto, apesar da contínua adesão e sobrevivência do tecido do doador, os enxertos que não conseguiram manter as células imunes humanas são considerados malsucedidos. A análise dos cortes corados com hematoxilina e eosina do enxerto após 35 dias mostrou epiderme intacta e a derme é moderadamente celular composta por fibroblastos ovais rechonchudos com citoplasma sincicial pálido e linfócitos dispersos. A análise do enxerto após 50 dias mostrou resultados semelhantes com epiderme intacta e derme contendo fibroblastos ovais e deposição de matriz extracelular levemente aumentada.
Os xenoenxertos de pele bem-sucedidos dependem da preparação adequada de amostras de pele, da supressão das respostas imunes neutrofílicas de camundongos pela administração de anti-Gr1, da adesão a métodos de cirurgia asséptica de roedores e do curativo seguro de camundongos. O modelo de transplante de pele de xenoenxerto humano permite que os pesquisadores estudem as respostas imunes humanas no órgão intacto in vivo, fornecendo um novo caminho para a pesquisa translacional.
