مختبري متخصص في نمذجة الأورام ثلاثية ورباعية الأبعاد. تستخدم النماذج الكروية للورم على نطاق واسع في جميع أنحاء البيولوجيا واكتشاف الأدوية. ومع ذلك ، فإن البروتوكولات الحالية لجمع البيانات من هذه التجارب مكلفة وصعبة ومحدودة.
يتطلب هذا البروتوكول مواد كيميائية ومعدات يسهل الوصول إليها ، وهو ليس كثيف العمالة مقارنة بالطرق الحالية التي توفر نتائج مماثلة. تم تطوير هذا البروتوكول ليكون سهل التنفيذ نسبيا للمبتدئين وقويا للأخطاء الصغيرة ، حيث أن العديد من الخطوات قابلة للعكس. ابدأ بوزن 0.5 جرام من الأغاروز منخفض الذوبان في زجاجة زجاجية.
وإضافة 25 ملليلتر من PBS. تذوب الأغاروز عن طريق غلي المحلول في الميكروويف لمدة 30 إلى 60 ثانية مع إغلاق الغطاء ، والدوران المستمر. يزن تسعة غرامات من N ، N ، N'N'Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine ، 22 غراما من اليوريا ، 44 غراما من السكروز ، 0.1 غرام من Triton X-100 ، و 24.9 غراما من الماء منزوع الأيونات.
سخني المحلول في حمام مائي 56 درجة مئوية مع خلط مستمر. بعد إذابة البلورات ، ضع المحلول في درجة حرارة الغرفة للسماح للفقاعات التي تشكلت أثناء الخلط ، بالارتفاع إلى السطح. قم بإنشاء كرويات باستخدام طريقة تراكب الأغاروز الموضحة في مخطوطة النص.
اقطع طرف ماصة ملليلتر واحد باستخدام مشرط لتكبير الفتحة. باستخدام الماصة ، قم بشفط الكرويات من الآبار ونقلها إلى أنبوب مخروطي شفاف 1.5 ملليلتر. يمكن الجمع بين كرويات متعددة من نفس الظروف في نفس الأنبوب.
اغسل الكرويات مرتين في ملليلتر واحد من PBS ، ثم أضف محلول بارافورمالدهيد محايد بنسبة 4٪ تم تسخينه مسبقا واحتضن الكرويات عند 37 درجة مئوية. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة محلول بارافورمالديهايد واغسل الكرويات مرتين بملليلتر واحد من PBS. ثم للتلطيخ ، انقل ما يصل إلى 15 كرويا إلى أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر ، باستخدام ماصة.
تخلل الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من 0.5٪ Triton X-100 في PBS. ضع أنابيب PCR داخل 50 ملليلتر ، وأنابيب الغطاء اللولبي وقم بتغطية الأنبوب بورق الألومنيوم واحتضن الكرويات في درجة حرارة الغرفة مع إثارة خفيفة. بعد ساعتين ، استبدل المحلول ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة واحتضنه بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي ، قم بإزالة المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة قبل إضافة 75 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية واحتضنها عند أربع درجات مئوية لمدة يومين ونصف. بعد الحضانة ، قم بإزالة supernatant واغسل الكرويات مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS ، تحتوي على 0.1٪ Tween و 0.1٪ Triton X-100 أو PBS-TT. ثم احتضن مع 200 ميكرولتر من PBS-TT لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، قم بإزالة PBS-TT قبل إضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة يومين ونصف. بعد الحضانة ، قم بإزالة supernatant واغسله مرتين باستخدام PBS-TT ، قبل احتضانه ب 200 ميكرولتر من PBS-TT لمدة أربع ساعات. للتركيب ، استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر ، وانقل الكرويات الثابتة والملطخة إلى أنابيب PCR سعة 500 ميكرولتر ، عند أنبوب واحد لكل حالة.
استبدل المحلول ب 200 ميكرولتر من هلام الأغاروز السائل بنسبة 2٪ ، وأجهزة الطرد المركزي على الدوران السريع ، بالسرعة القصوى الثابتة ، في درجة حرارة الغرفة ، لمدة 30 ثانية. استنشق الكرويات في 50 ميكرولتر من هلام الأغاروز السائل واستغني عنه في بئر صفيحة سفلية زجاجية مكونة من 24 بئرا. قبل أن يصلب الجل ، افصل الكرويات باستخدام طرف ماصة في الجل المحيط ، وتأكد من تغطية الكرويات بالجل.
بعد ذلك ، غمر الجل بإضافة 500 ميكرولتر من محلول التطهير لكل بئر ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام ، لمدة 24 ساعة قبل التصوير. للتصوير ، اختر هدفا بمسافة عمل طويلة بما يكفي لتشمل الكروية بأكملها ، بما في ذلك الارتفاع المتصاعد للكروية في السفينة. لتحديد المستوى الاستوائي، اضبط التركيز البؤري حتى يتم الوصول إلى أكبر مساحة سطح في المستوى XY، وقم بتصوير الصورة باستخدام النسبة المئوية المطلوبة لطاقة الليزر، وجهد الكاشف، والكسب، وإعدادات الإزاحة.
بالنسبة للصور ثلاثية الأبعاد، اضبط بداية ونهاية الكرويات واختر شدة الإشارة المناسبة على أعماق Z المختلفة، باستخدام إعدادات تصحيح كثافة Z. تظهر هذه الدراسة مقارنة بين كرويات سرطان الجلد البشري FUCCI التي تم تطهيرها وغير الواضحة ، مقارنة بالكرويات المثبتة على PBS. يوفر حل المقاصة صورا عالية الوضوح مع الحد الأدنى من التشوه في الحجم.
يسمح حل المقاصة أيضا بتصوير عالي الدقة لتفاصيل المستوى الخلوي بشكل أعمق في الكرويات دون تقسيم نسيجي. باستخدام الصور البؤرية ثلاثية الأبعاد ، يمكن الحصول على تفاصيل المستوى الخلوي على عمق 200 ميكرون. علاوة على ذلك ، تظهر مقارنة بين كروية الثقب المجزأة بالتبريد وإزالتها ، الملطخة بالبيمونيدازول و p27kip1.
يظهر تلطيخ بيمونيدازول المنطقة الناقصة الأكسجة من الكروية ، وتلطيخ p27kip1 ، علامات القبض على دورة الخلية ووصمة عار DAPI النووية. اختراق أعمق وتشتت أقل ، يسمح بتمثيل محسن للهيكل الكروي ثلاثي الأبعاد مع الحد الأدنى من فقدان الضوء. يتم عرض العرض ثلاثي الأبعاد للكرويات FUCCI ، الملطخة ب DRAQ7.
حل المقاصة له تأثير ضئيل على حجم الكروي. تم تعريف قطر الكروية بناء على كرة لها نفس مساحة المقطع العرضي مثل الكروية. لوحظ أن الكرويات تزداد قليلا في الحجم خلال الساعات الست الأولى ، كما هو موضح في تغيير القطر بين 2٪ و 6٪ في المقابل ، بعد 24 إلى 72 ساعة ، عادت الكرويات إلى حجم مساو تقريبا للحجم المقابل في تثبيت PBS بعد paraformaldehyde.
من المهم الانتظار لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التصوير ، للسماح لمحلول المقاصة بالتوازن مع الكرويات والجل. يسمح هذا البروتوكول للممارسين بجمع البيانات بسرعة من أعداد كبيرة من الكرويات ، مما يسمح بإجراء تحليل رياضي وإحصائي كمي مفصل يوفر رؤى مفصلة في علم الأحياء.
