Mi laboratorio se especializa en el modelado de tumores tridimensionales y cuatridimensionales. Los modelos de esferoides tumorales son ampliamente utilizados en biología y descubrimiento de fármacos. Sin embargo, los protocolos existentes para recopilar datos de estos experimentos son costosos, difíciles y limitados.
Este protocolo requiere productos químicos y equipos de fácil acceso, y no requiere mucha mano de obra en comparación con los métodos actuales que proporcionan resultados similares. Este protocolo fue desarrollado para ser relativamente fácil de implementar para principiantes y robusto a pequeños errores, ya que muchos de los pasos son reversibles. Comience pesando 0.5 gramos de agarosa de bajo punto de fusión en una botella de vidrio.
Y agregue 25 mililitros de PBS. Derrita la agarosa hirviendo la solución en un microondas durante 30 a 60 segundos con la tapa cerrada y un remolino constante. Pesar nueve gramos de N, N, N'N'Tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina, 22 gramos de urea, 44 gramos de sacarosa, 0.1 gramos de Triton X-100 y 24.9 gramos de agua desionizada.
Caliente la solución en un baño de agua de 56 grados centígrados con una mezcla constante. Después de que los cristales se disuelvan, descanse la solución a temperatura ambiente para permitir que las burbujas formadas durante la mezcla suban a la superficie. Generar esferoides utilizando el método de superposición de agarosa descrito en el texto manuscrito.
Corte la punta de una punta de pipeta de un mililitro con un bisturí para agrandar el orificio. Usando la pipeta, aspire los esferoides de los pocillos y transfiéralos a un tubo cónico transparente de 1,5 mililitros. Múltiples esferoides de las mismas condiciones se pueden combinar en el mismo tubo.
Lave los esferoides dos veces en un mililitro de PBS, luego agregue una solución de paraformaldehído precalentado neutro al 4% e incube los esferoides a 37 grados centígrados. Después de 20 minutos, retire la solución de paraformaldehído y lave los esferoides dos veces con un mililitro de PBS. Luego, para la tinción, transfiera hasta 15 esferoides a un tubo de PCR de 200 microlitros, usando una pipeta.
Permeabilizar las células utilizando 200 microlitros de 0,5% Triton X-100 en PBS. Coloque los tubos de PCR dentro de tubos de tapón de rosca de 50 mililitros y cubra el tubo con papel de aluminio e incube los esferoides a temperatura ambiente con una agitación suave. Después de dos horas, reemplace la solución con 200 microlitros de tampón de dilución de anticuerpos e incube durante la noche a temperatura ambiente.
Al día siguiente, retire el tampón de dilución de anticuerpos antes de agregar 75 microlitros de anticuerpo primario e incube a cuatro grados centígrados durante dos días y medio. Después de la incubación, retire el sobrenadante y lave los esferoides dos veces con 200 microlitros de PBS, que contienen 0.1% Tween y 0.1% Triton X-100 o PBS-TT. Luego incubar con 200 microlitros de PBS-TT durante cuatro horas a temperatura ambiente.
A continuación, retire PBS-TT antes de agregar 100 microlitros del anticuerpo secundario e incube a cuatro grados centígrados durante dos días y medio. Después de la incubación, retire el sobrenadante y lávese dos veces con PBS-TT, antes de incubar con 200 microlitros de PBS-TT durante cuatro horas. Para el montaje, use una pipeta de 200 microlitros, transfiera los esferoides fijos y teñidos a tubos de PCR de 500 microlitros, a un tubo por condición.
Reemplace la solución con 200 microlitros de gel de agarosa líquida al 2% y centrifugar en el centrifugado rápido, a la velocidad máxima fija, a temperatura ambiente, durante 30 segundos. Aspirar los esferoides en 50 microlitros de gel líquido de agarosa y dispensar en el pocillo de una placa inferior de vidrio de 24 pocillos. Antes de que el gel se endurezca, separe los esferoides con una punta de pipeta en el gel circundante y asegúrese de que los esferoides estén cubiertos con gel.
A continuación, sumerja el gel agregando 500 microlitros de solución de limpieza por pozo e incube a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 24 horas antes de la toma de imágenes. Para obtener imágenes, elija un objetivo con una distancia de trabajo lo suficientemente larga como para abarcar todo el esferoide, incluida la altura de montaje del esferoide en el recipiente. Para identificar el plano ecuatorial, ajuste el enfoque hasta que se alcance el área de superficie más grande en el plano XY e imagine con el porcentaje de potencia del láser, el voltaje del detector, la ganancia y la configuración de desplazamiento requeridos.
Para imágenes tridimensionales, establezca el inicio y el final de los esferoides y elija la intensidad de señal adecuada a varias profundidades Z, utilizando los ajustes de corrección de intensidad Z. Este estudio muestra una comparación de los esferoides de melanoma humano FUCCI aclarados y no aclarados, en comparación con los esferoides montados en PBS. La solución de limpieza proporciona imágenes de alta claridad con una distorsión de tamaño mínima.
La solución de limpieza permite además obtener imágenes de alta resolución de detalles a nivel celular más profundos en los esferoides sin sección histológica. Con imágenes confocales tridimensionales, se pueden obtener detalles a nivel celular a una profundidad de 200 micras. Además, se muestra una comparación entre el esferoide de orificio crioseccionado y despejado, teñido para pimonidazol y p27kip1.
La tinción de pimonidazol muestra la región hipóxica del esferoide, y la tinción de p27kip1 marca la detención del ciclo celular y la tinción nuclear DAPI. Una penetración más profunda y una menor dispersión permiten una mejor representación de la estructura esferoide tridimensional con una pérdida de luz mínima. Se muestra la representación tridimensional de los esferoides FUCCI, teñidos con DRAQ7.
La solución de limpieza tiene un impacto mínimo en el tamaño del esferoide. El diámetro del esferoide se definió en base a una esfera con la misma área de sección transversal que el esferoide. Se observó que los esferoides aumentaron ligeramente de tamaño durante las primeras seis horas, como lo indica un cambio de pliegue de diámetro de entre 2% y 6%En contraste, después de 24 a 72 horas, los esferoides volvieron a un tamaño aproximadamente igual al tamaño correspondiente en la fijación de PBS post-paraformaldehído.
Es importante esperar al menos 24 horas antes de la toma de imágenes, para permitir que la solución de limpieza se equilibre con los esferoides y el gel. Este protocolo permite a los profesionales recopilar rápidamente datos de un gran número de esferoides, lo que permite un análisis cuantitativo matemático y estadístico detallado que proporciona información detallada sobre la biología.
