Моя лаборатория специализируется на трех- и четырехмерном моделировании опухолей. Модели сфероидов опухолей широко используются во всей биологии и открытии лекарств. Однако существующие протоколы сбора данных из этих экспериментов являются дорогостоящими, сложными и ограниченными.
Этот протокол требует легкодоступных химических веществ и оборудования и не очень трудоемкий по сравнению с современными методами, которые обеспечивают аналогичные результаты. Этот протокол был разработан, чтобы быть относительно простым в реализации для начинающих и устойчивым к небольшим ошибкам, так как многие из шагов являются обратимыми. Начните с взвешивания 0,5 грамма низкоплавкой агарозы в стеклянной бутылке.
И добавьте 25 миллилитров PBS. Расплавьте агарозу, кипятя раствор в микроволновой печи в течение 30-60 секунд с закрытой крышкой и постоянным закручиванием. Взвесьте девять граммов N, N, N'N'Tetrakis(2-гидроксипропил)этилендиамина, 22 грамма мочевины, 44 грамма сахарозы, 0,1 грамма Triton X-100 и 24,9 грамма деионизированной воды.
Нагрейте раствор на водяной бане с температурой 56 градусов Цельсия с постоянным перемешиванием. После того, как кристаллы растворяются, оставьте раствор при комнатной температуре, чтобы пузырьки, образовавшиеся во время смешивания, поднялись на поверхность. Генерация сфероидов с помощью метода наложения агарозы, описанного в текстовой рукописи.
Вырежьте наконечник пипетки на один миллилитр с помощью скальпеля, чтобы увеличить отверстие. Используя пипетку, аспирировать сфероиды из скважин и перенести их в прозрачную коническую трубку объемом 1,5 миллилитра. Несколько сфероидов из одних и тех же условий могут быть объединены в одной трубе.
Промыть сфероиды дважды в одном миллилитре PBS, затем добавить нейтральный 4% предварительно нагретый раствор параформальдегида и инкубировать сфероиды при 37 градусах Цельсия. Через 20 минут удалить раствор параформальдегида и дважды промыть сфероиды одним миллилитром PBS. Затем для окрашивания переложите до 15 сфероидов в 200-микролитровую ПЦР-трубку, используя пипетку.
Пермеабилизируйте клетки, используя 200 микролитров 0,5% Triton X-100 в PBS. Поместите трубки ПЦР внутрь 50 миллилитров, завинтите трубки и накройте трубку алюминиевой фольгой и инкубируйте сфероиды при комнатной температуре с легким перемешиванием. Через два часа заменить раствор 200 микролитрами буфера разбавления антител и инкубировать на ночь при комнатной температуре.
На следующий день удалите буфер разбавления антител перед добавлением 75 микролитров первичного антитела и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение двух с половиной дней. После инкубации удалите супернатант и дважды промойте сфероиды 200 микролитрами PBS, содержащими 0,1% анимации и 0,1% Triton X-100 или PBS-TT. Затем инкубируют с 200 микролитрами PBS-TT в течение четырех часов при комнатной температуре.
Далее удаляют PBS-TT перед добавлением 100 микролитров вторичного антитела и инкубируют при четырех градусах Цельсия в течение двух с половиной дней. После инкубации удалите супернатант и дважды промыть PBS-TT, перед инкубацией с 200 микролитрами PBS-TT в течение четырех часов. Для монтажа используйте 200-микролитровую пипетку, перенесите неподвижные и окрашенные сфероиды в 500 микролитровые трубки ПЦР по одной трубке для каждого состояния.
Замените раствор 200 микролитрами 2%-го жидкого агарозного геля, и центрифугу на быстром отжиме, на фиксированной максимальной скорости, при комнатной температуре, в течение 30 секунд. Аспирировать сфероиды в 50 микролитрах жидкого агарозного геля и дозировать в лунке 24-луночной стеклянной донной пластины. Прежде чем гель затвердеет, отделите сфероиды с помощью кончика пипетки в окружающем геле и убедитесь, что сфероиды покрыты гелем.
Затем погружают гель, добавляя 500 микролитров очищающего раствора на лунку, и инкубируют при комнатной температуре, в темноте, в течение 24 часов перед визуализацией. Для визуализации выберите объектив с рабочим расстоянием, достаточно большим, чтобы охватить весь сфероид, включая высоту крепления сфероида в сосуде. Чтобы идентифицировать экваториальную плоскость, отрегулируйте фокус до тех пор, пока не будет достигнута наибольшая площадь поверхности в плоскости XY, и изображение с требуемым процентом мощности лазера, напряжением детектора, коэффициентом усиления и настройками смещения.
Для трехмерных изображений установите начало и конец сфероидов и выберите соответствующую интенсивность сигнала на различных Z-глубинах, используя настройки коррекции интенсивности Z. Это исследование показывает сравнение очищенных и неочищенных сфероидов меланомы человека FUCCI по сравнению с сфероидами, установленными PBS. Решение для очистки обеспечивает высокую четкость изображений с минимальными искажениями размера.
Клиринговое решение также позволяет получать изображения деталей клеточного уровня с высоким разрешением глубже в сфероиды без гистологического сечения. С помощью трехмерных конфокальных изображений можно получить детали клеточного уровня на глубине 200 мкм. Далее показано сравнение между криосекционным и очищенным сфероидом отверстий, окрашенным для пимонидазола и p27kip1.
Окрашивание пимонидазолом показывает гипоксическую область сфероида, а окрашивание p27kip1 отмечает остановку клеточного цикла и ядерное окрашивание DAPI. Более глубокое проникновение и меньшее рассеяние позволяют улучшить трехмерное представление структуры сфероидов с минимальными потерями света. Показан трехмерный рендеринг сфероидов FUCCI, окрашенных DRAQ7.
Очищающий раствор оказывает минимальное влияние на размер сфероида. Диаметр сфероида был определен на основе сферы с той же площадью поперечного сечения, что и сфероид. Наблюдалось, что сфероиды незначительно увеличиваются в размерах в течение первых шести часов, о чем свидетельствует изменение диаметра складки между 2% и 6% Напротив, через 24-72 часа сфероиды вернулись к размеру, примерно равному соответствующему размеру в постпарформальдегидной фиксации PBS.
Важно подождать не менее 24 часов перед визуализацией, чтобы очищающий раствор уравновешивался со сфероидами и гелем. Этот протокол позволяет практикам быстро собирать данные из большого количества сфероидов, что позволяет проводить подробный количественный математический и статистический анализ, который дает подробное представление о биологии.
