הפרוטוקול שלנו לבידוד מזנכימה במעי מביא לתשואה גבוהה של טלוציטים. שיטה זו מציעה פלטפורמה ראשונית לחקר אינטראקציה בין תאים המערבת טלוציטים בהומאוסטזיס ובמחלות. טלוציטים הם תאים ייחודיים הרגישים לפרוטוקולי דיסוציאציה של רקמות זמינות.
לכן, היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בידוד של mesenchyme, כולל telocytes קיימא מועשר. מזנכימה, כולל טלוציטים, יכולה לשמש כמקור למולקולות איתות וגורמי גדילה הדרושים לגדילה מאורגנת ex vivo. כדי להתחיל, לשטוף את המעי, מופרד עכבר המתת חסד, בצלחת פטרי המכילה PBS קר וסטרילי.
מניחים את המעי בצלחת פטרי. ובאמצעות מספריים בקצה הכדור, לפתוח את צינור המעי לאורך, ולשטוף את הצואה. מעבירים את המעי לצלחת חדשה המכילה PBS טרי וקר.
לאחר שטיפת המעי פעם נוספת, לחתוך את המעי הדק למקטעים באורך סנטימטר, ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא שמונה מיליליטר של PBS. נערו את הצינור ידנית במחזור אחד או שניים בשנייה למשך דקה. יוצקים את התמיסה לצלחת פטרי.
ובאמצעות מלקחיים, להעביר את הקטע לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מלא 20 מיליליטר של פתרון A.מניחים את הצינורות באינקובטור שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה, נערו את הצינור במרץ ביד בארבעה או חמישה מחזורים בשנייה למשך דקה אחת כדי לנתק את האפיתל. חזור על שלב זה פעם נוספת.
לאחר חיתוך ושטיפת השברים כפי שהודגם קודם לכן, העבירו אותם לצינור חדש של 50 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי, והפכו את הצינור במחזור אחד או שניים לשנייה למשך דקה. יוצקים את התמיסה לצלחת פטרי. העבירו את המקטעים לצינור חדש של 15 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של PBS סטרילי, והטו מעלה ומטה בעדינות במחזור אחד או שניים לשנייה למשך שתי דקות.
מתחת לארון בטיחות ביולוגית, השתמשו במלקחיים כדי להניח את המקטעים על מגבון מעבדה סטרילי כדי לייבש אותם. לאחר הייבוש, לחתוך את הפלחים עוד לחתיכות. מעבירים את החתיכות החתוכות בעזרת מלקחיים לצלחת בת שש בארות מלאה בארבעה מיליליטר של תמיסת עיכול שחוממה מראש לכל באר.
דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך 50 דקות, ומנערים את הצלחת ידנית בעדינות כל 20 דקות. לאחר מכן, להעביר את חתיכות באמצעות פיפטה פסטר לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא ארבעה מיליליטר של DMEM. נערו את הצינור ידנית בארבעה או חמישה מחזורים בשנייה למשך דקה אחת כדי לקבל השעיה של תא יחיד.
מסננים את המתלה דרך מסננת של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את התסנין ב 700 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט על ידי שאיפה, והשעו מחדש את גלולת התא בחמישה מיליליטר של 2% FBS/PBS.
לאחר צנטריפוגה של המתלה פעם נוספת ב 700 גרם במשך חמש דקות, להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 12 מיליליטר של מדיום תרבית. לבסוף, זרעו את השעיית התא בצלחות שש בארות. בעקבות דיסוציאציה של מזנכימה, הטלוציטים מאבדים את המאפיינים התאיים שלהם, מראים מורפולוגיה תאית עגולה, ומחזירים פחות תאים חיוביים ל-GFP ביום הראשון בהשוואה לימים שלאחר מכן.
כמה ימים לאחר מכן, הטלוציטים מציגים מורפולוגיית תא קטנה ומתוחה עם תהליכים תאיים קצרים. לאחר שבעה עד 10 ימים של זריעה, הטלוציטים חוזרים למאפיינים התאיים שלהם, ומראים מורפולוגיה תאית גדולה ומתוחה עם תהליכים ציטופלזמיים ארוכים. ציטומטריית זרימה חושפת את הרכב התא.
בסך הכל, 69% מהתאים המבודדים היו בני קיימא בהתבסס על צביעת DAPI. ומתוכם, 60.9% ייצגו זיהום אפיתל ותאי מערכת החיסון והאנדותל. מקטע הטלוציטים התפזר מעל 100k ו-70k FSC ו-SSC, בהתאמה, וייצג כמעט 10% מהמזנכימה המגודרת.
ניתוח FACS גילה כי ניתן להגדיר את תת-הקבוצה של טלוציטים על ידי צביעה חיובית ל- CD201 ו- GP38. בדיקה חיסונית של מזנכימה בתרבית חד-יומית באמצעות סמנים אלה הראתה ביטוי של סמנים מולקולריים אלה, למרות שהתאים לא הציגו את המאפיינים התאיים שלהם. הליך זה מביא להשעיה בת קיימא של תא בודד של תאי סטרומה, אשר ניתן להשתמש בהם לא רק לתרבית דו-ממדית אלא לכל יישום אחר, כגון תרבית משותפת תלת-ממדית עם אורגנואידים או הדפסה ביולוגית.
