Unser Protokoll zur Isolierung des intestinalen Mesenchyms führt zu einer hohen Ausbeute an Telozyten. Diese Methode bietet eine erste Plattform, um die Zell-Zell-Interaktion von Telozyten in Homöostase und Krankheit zu untersuchen. Telozyten sind einzigartige Zellen, die empfindlich auf verfügbare Gewebedissoziationsprotokolle reagieren.
Daher ist der Hauptvorteil dieser Technik die Isolierung von Mesenchym, einschließlich angereicherter lebensfähiger Telozyten. Mesenchym, einschließlich Telozyten, kann als Quelle für Signalmoleküle und Wachstumsfaktoren dienen, die für ein organisiertes Wachstum ex vivo erforderlich sind. Waschen Sie zunächst den Darm, getrennt von einer eingeschläferten Maus, in einer Petrischale, die kaltes, steriles PBS enthält.
Legen Sie den Darm in eine Petrischale. Öffnen Sie den Darm mit einer Kugelschere in Längsrichtung und waschen Sie den Kot aus. Übertragen Sie den Darm in eine neue Schüssel mit frischem, kaltem PBS.
Nachdem Sie den Darm noch einmal gewaschen haben, schneiden Sie den Dünndarm in einen Zentimeter lange Segmente und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das mit acht Millilitern PBS gefüllt ist. Schütteln Sie das Röhrchen manuell mit ein oder zwei Zyklen pro Sekunde für eine Minute. Gießen Sie die Lösung in eine Petrischale.
Übertragen Sie das Segment mit einer Pinzette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 20 Millilitern Lösung A gefüllt ist.Legen Sie die Röhrchen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Orbital-Shaker-Inkubator. Schütteln Sie das Röhrchen nach der Inkubation eine Minute lang mit vier oder fünf Zyklen pro Sekunde kräftig von Hand, um das Epithel zu dissoziieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
Nachdem Sie die Fragmente wie zuvor gezeigt geschnitten und gewaschen haben, geben Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 10 Millilitern sterilem PBS gefüllt ist, und drehen Sie das Röhrchen eine Minute lang mit einem oder zwei Zyklen pro Sekunde um. Gießen Sie die Lösung in eine Petrischale. Übertragen Sie die Segmente in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen, das mit 10 Millilitern sterilem PBS gefüllt ist, und kippen Sie sie zwei Minuten lang sanft mit ein oder zwei Zyklen pro Sekunde auf und ab.
Legen Sie die Segmente unter einer Biosicherheitswerkbank mit einer Pinzette auf ein steriles Labortuch, um sie zu trocknen. Schneiden Sie die Segmente nach dem Trocknen weiter in Stücke. Übertragen Sie die geschnittenen Stücke mit einer Pinzette in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit vier Millilitern vorgewärmter Aufschlusslösung pro Vertiefung gefüllt ist.
Inkubieren Sie die Platte 50 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie die Platte alle 20 Minuten vorsichtig. Übertragen Sie die Stücke dann mit einer Pasteur-Pipette in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das mit vier Millilitern DMEM gefüllt ist. Schütteln Sie das Röhrchen eine Minute lang manuell mit vier oder fünf Zyklen pro Sekunde, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
Filtrieren Sie die Suspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Das Filtrat wird bei 700 g fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern 2% FBS/PBS.
Nachdem Sie die Suspension fünf Minuten lang noch einmal bei 700 g zentrifugiert haben, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 12 Milliliter Nährmedium. Zum Schluss säen Sie die Zellsuspension in Sechs-Well-Platten. Nach der Mesenchym-Dissoziation verlieren die Telozyten ihre zellulären Eigenschaften, zeigen eine runde zelluläre Morphologie und spiegeln am ersten Tag im Vergleich zu den folgenden Tagen eine geringere Anzahl von GFP-positiven Zellen wider.
Wenige Tage später zeigen die Telozyten eine kleine, gestreckte Zellmorphologie mit kurzen zellulären Fortsätzen. Nach sieben bis 10 Tagen der Aussaat erlangen die Telozyten ihre zellulären Eigenschaften zurück und zeigen eine große, gestreckte Zellmorphologie mit langen zytoplasmatischen Prozessen. Die Durchflusszytometrie zeigt die Zellzusammensetzung.
Insgesamt waren 69% der isolierten Zellen auf der Grundlage der DAPI-Färbung lebensfähig. Und von diesen repräsentierten 60,9% epitheliale Kontamination sowie Immun- und Endothelzellen. Die Telozytenfraktion streute über 100k bzw. 70k FSC bzw. SSC und machte fast 10% des Gated Mesenchyms aus.
Die FACS-Analyse ergab, dass die Untergruppe der Telozyten durch positive Färbung an CD201 und GP38 definiert werden kann. Die Immunfärbung von eintägig kultiviertem Mesenchym unter Verwendung dieser Marker zeigte die Expression dieser molekularen Marker, obwohl die Zellen ihre zellulären Eigenschaften nicht aufwiesen. Dieses Verfahren führt zu einer lebensfähigen Einzelzellsuspension von Stromazellen, die nicht nur für die 2D-Kultur, sondern auch für jede andere Anwendung verwendet werden kann, wie z. B. die 3D-Kokultur mit Organoiden oder das Bioprinting.
