Bağırsak mezenkimini izole etme protokolümüz yüksek telosit verimi ile sonuçlanır. Bu yöntem, homeostaz ve hastalıkta telositleri içeren hücre-hücre etkileşimini incelemek için bir başlangıç platformu sunar. Telositler, mevcut doku ayrışma protokollerine duyarlı benzersiz hücrelerdir.
Bu nedenle, bu tekniğin temel avantajı, zenginleştirilmiş canlı telositler de dahil olmak üzere mezenkimin izolasyonudur. Telosit de dahil olmak üzere mezenkim, ex vivo organize büyüme için gerekli olan sinyal molekülleri ve büyüme faktörleri için bir kaynak olarak hizmet edebilir. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir fareden ayrılmış bağırsağı, soğuk, steril PBS içeren bir Petri kabında yıkayın.
Bağırsağı bir Petri kabına yerleştirin. Ve bilyalı makas kullanarak, bağırsak tüpünü uzunlamasına açın ve dışkıyı yıkayın. Bağırsağı taze, soğuk PBS içeren yeni bir kaba aktarın.
Bağırsağı bir kez daha yıkadıktan sonra, ince bağırsağı bir santimetre uzunluğunda segmentlere ayırın ve sekiz mililitre PBS ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Tüpü bir dakika boyunca saniyede bir veya iki döngüde manuel olarak çalkalayın. Çözeltiyi bir Petri kabına dökün.
Forseps kullanarak, segmenti 20 mililitre Çözelti A ile doldurulmuş 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Tüpleri 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcı inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyondan sonra, epiteli ayrıştırmak için tüpü bir dakika boyunca saniyede dört veya beş döngüde elle kuvvetlice sallayın. Bu adımı bir kez daha yineleyin.
Parçaları daha önce gösterildiği gibi kestikten ve yıkadıktan sonra, bunları 10 mililitre steril PBS ile doldurulmuş yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpü bir dakika boyunca saniyede bir veya iki döngüde ters çevirin. Çözeltiyi bir Petri kabına dökün. Segmentleri 10 mililitre steril PBS ile doldurulmuş yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve iki dakika boyunca saniyede bir veya iki döngüde hafifçe yukarı ve aşağı doğru eğin.
Bir biyogüvenlik kabininin altında, segmentleri kurutmak için steril bir laboratuvar mendiline yerleştirmek için forseps kullanın. Kuruduktan sonra, segmentleri daha da parçalara ayırın. Forseps kullanarak kesilmiş parçaları, kuyucuk başına dört mililitre önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi ile doldurulmuş altı kuyucuklu bir plakaya aktarın.
Plakayı 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve plakayı her 20 dakikada bir manuel olarak hafifçe sallayın. Ardından, parçaları bir Pasteur pipeti kullanarak dört mililitre DMEM ile doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpü bir dakika boyunca saniyede dört veya beş döngüde manuel olarak sallayın.
Süspansiyonu 100 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Filtratı 700 g'da dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı aspirasyonla atın ve hücre peletini beş mililitre% 2 FBS / PBS'de yeniden askıya alın.
Süspansiyonu beş dakika boyunca 700 g'da bir kez daha santrifüj ettikten sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini 12 mililitre kültür ortamında yeniden askıya alın. Son olarak, hücre süspansiyonunu altı delikli plakalara tohumlayın. Mezenkim dissosiyasyonunu takiben, telositler hücresel özelliklerini kaybeder, yuvarlak hücresel morfoloji gösterir ve ilk günde sonraki günlere kıyasla daha az sayıda GFP-pozitif hücre yansıtır.
Birkaç gün sonra, telositler kısa hücresel süreçlerle küçük, gerilmiş bir hücre morfolojisi sergiler. Yedi ila 10 günlük tohumlamadan sonra, telositler hücresel özelliklerini yeniden kazanır ve uzun sitoplazmik süreçlerle büyük, gerilmiş hücre morfolojisini gösterir. Akım sitometrisi hücre kompozisyonunu ortaya çıkarır.
Genel olarak, izole edilen hücrelerin% 69'u DAPI boyamasına dayanarak yaşayabilirdi. Ve bunların% 60.9'u epitel kontaminasyonunu ve immün ve endotel hücrelerini temsil ediyordu. Telosit fraksiyonu sırasıyla 100k ve 70k FSC ve SSC'nin üzerine dağıldı ve kapılı mezenkimin neredeyse% 10'unu temsil etti.
FACS analizi, telositlerin alt kümesinin CD201 ve GP38'e pozitif boyama ile tanımlanabileceğini ortaya koymuştur. Bu belirteçler kullanılarak bir günlük kültürlü mezenkimin immün boyaması, hücrelerin hücresel özelliklerini sergilememesine rağmen, bu moleküler belirteçlerin ekspresyonunu göstermiştir. Bu prosedür, sadece 2D kültür için değil, organoidlerle 3D ko-kültür veya biyobaskı gibi başka herhangi bir uygulama için de kullanılabilen stromal hücrelerin uygulanabilir tek hücreli süspansiyonu ile sonuçlanır.
