פרוטוקול זה מספק מודלים של PDAC in vivo הניתנים לשחזור, בעלי יכולת חיסונית, המתאימים למחקרי גנוטיפ, פנוטיפ ותגובה לתרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יכולתה לסייע בחקירת התקדמות הגידול עם מיקרו-סביבה ביולוגית סינגנית של הגידול תוך שמירה על יכולת השחזור של הניסוי. מי שידגימו את ההליך יהיו סטפני ברתל וקיארה פלקומטה, שתיהן מהמעבדה שלנו.
התחל את הכנת תאי הגידול על ידי שטיפת אדנוקרצינומה צינורית הלבלב, או תאי PDAC, גדל בבקבוק תרבית T75 עם מלח חוצץ פוספט או PBS. לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר של טריפסין במשך חמש עד 10 דקות כדי לנתק מן הצלוחית. יש להשהות מחדש את התאים המנותקים ב-10 מיליליטר DMEM עם 10% נסיוב בקר עוברי, או FBS, ו-0.1% פניצילין סטרפטומיצין לפני העברת תרחיף התאים לצינור של 15 מיליליטר.
צנטריפוגו את מתלה התא ב-200G למשך חמש דקות ושאפו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את גלולת התא ב- DMEM ללא תוספים, בהתבסס על הריכוז הסופי הנדרש של התאים להזרקה. ספרו את התאים ב-10 מיקרוליטר של השעיית תאים, באמצעות תא נויבאואר וחשבו את מספר התאים הזמינים.
מעבירים מיליליטר אחד של התרחיף המדולל, לפי הריכוז הסופי הנדרש, לצינור של 1.5 מיליליטר. הניחו את הצינור על מסובב עד להשתלה כדי למנוע צבירת תאים. להשתלה אורתוטופית של תאי PDAC, יש למרוח קרם עיניים על העכבר בזמן שהעכבר ישן.
בדוק את analgosedation מספיק לפני גילוח האגף השמאלי לטרלי הבטן של העכבר analgosedated. הניחו את העכבר, שוכב על צד ימין, על משטח חימום סטרילי והדביקו את הרגליים אל פני השטח. ללבוש כפפות חדשות ולחטא אותם.
בעזרת מספריים כירורגיים, חותכים כסנטימטר אחד של העור ורקמת שומן תת עורית לאורך בצד שמאל שבו הטחול מוקרן. באמצעות מספריים ומלקחיים, להפריד את העור מן הצפק כדי לקבל גישה קלה יותר הצפק. שנה את זוג מספריים לפני פתיחת הצפק במיקום הטחול עם חתך אורכי של סנטימטר אחד.
בעת גיוס הטחול והלבלב המחובר באמצעות מלקחיים קהים ועדינים, יש לוודא שהאיברים אינם מחוברים לרקמות אחרות. בדוק גם את כלי הדם המספקים כדי למנוע פגיעה בכלי הדם או ברקמה שמסביב בעת הטיפול בלבלב. משכו בזהירות את הלבלב מהחתך כדי לאפשר גישה קלה יותר לזנב האיבר והתבוננו בטחול בעקבות הלבלב.
ודא כי האיבר אינו מקופל במהלך ההזרקה ואת הקפסולה של האיבר מוחזק תחת מתח באתר חדירת המחט כדי למנוע שפיכה. יש לכוון לחתיכת רקמת לבלב בין כלי הדם הנראים לעין כדי למזער את הסיכון לניקוב או הזרקת כלי הדם. בעזרת היד הדומיננטית, חודרים בזהירות לקפסולת האיבר עם צינורית 27 מד ומזרק 50 מיקרוליטר בעקבות ציר האורך של האיבר.
לאחר הזרקת 20 מיקרוליטר של השעיה המכילה 2, 500 תאים לאזור הזנב של הלבלב, לשמור את הלבלב ואת מזרק מוכנס עדיין במשך כדקה אחת כדי למנוע שפיכת תאי הגידול. לאחר מכן, הסר את המחט מאתר ההזרקה. לאחר מכן, בזהירות לארגן מחדש את האיברים בתוך הבטן מבלי לפגוע ברקמה כדי למנוע שפיכת התאים.
הימנע הידבקות איברים על ידי שפיכת מיליליטר אחד של 0.9% נתרן כלורי על האיברים. לאחר תפירת הצפק בטכניקת התפר הקטוע הפשוטה, סגור את העור באמצעות שניים עד שלושה אטבי פצע נירוסטה תשעה מ"מ. ואז אנטגוניזם את analgosedation עם midazolam, medetomadine, ופנטניל, או MMF, עם הזרקה תת עורית של AFN על פי משקל הגוף של העכבר.
לאחר שתסיים, הכנס את העכבר לתא מחומם של 37 מעלות צלזיוס עד שהוא ער ופעיל לחלוטין. החזירו את העכבר הפעיל לכלוב המקורי ועקבו אחר מצבו הבריאותי של העכבר על ידי בדיקת הפרווה, צבע העור והפעילות, וחזרו על הפעולה שלוש עד ארבע שעות לאחר הניתוח. ב-MRI של עכבר מושתל, השתלת תאי PDAC מיששה את הבטן מוקדם ביותר בערך שבעה ימים לאחר הניתוח, תלוי במספר התאים שהוזרקו ובמאפייני האגרסיביות והגדילה של קו התאים המחוסן.
הישרדותם של העכברים המושתלים שהתקבלה השתנתה בהתאם לתכונות הפנימיות של תאי הגידול של קווי התא. זריקות תוך לבלב מוצלחות הובילו לגידולים מלאים בלבלב העכבר. לעומת זאת, השתלות לא מוצלחות גרמו להיעדר גידולים בלבלב בגלל הזרקה של תאים שאינם ברי קיימא, דחייה של התאים המושתלים או הזרקה של מספר לא מספיק של תאים.
זכרו לשים לב לא לשפוך תאים במהלך הזריקות ולא לפגוע ברקמה שמסביב כדי למנוע תאים להתפשט בתוך הבטן. לאחר הליך זה, מחקרי in vivo, כמו מחקרי תגובה פרה-קליניים לתרופות, יכולים להתבצע בעכברים בעלי יכולת חיסונית, ולאחר מכן, למשל, עובדות, ריצוף או ניתוח היסטולוגי כדי לחקור אינטראקציות בין מארחי גידולים.
