פרוטוקול זה הוא עבור חיתוך ו culturing רקמת הלב קטעים במשך שישה ימים תחת תנאים פיזיולוגיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור בדיקות רעילות לב חריפה, כמו גם בדיקת היעילות של טיפולים אי ספיקת לב. מערכת תרבות זו יש פוטנציאל להיות אדם חיזוי רב עוצמה במודל situ לבדיקות רעילות לב חריפה כי סוגר את הפער בין תוצאות בדיקות פרה קליניות קליניות. הדגמת ההליכים תהיה צ'ינגהוי קו, מנהל מעבדה מהמעבדה שלנו.
כדי להשיג פרוסות רקמת לב חזיר, ראשית להוסיף קרח ז'קט קירור אמבטיה רקמה של רטט ולהוסיף פתרון Tyrode לאמבטיה. השתמש בצנצנת פלסטיק של ליטר אחד כדי לאסוף את נגר הקרח המומס ממעיל הקירור של אמבט הרקמות ולהעביר את לב החזיר למגש המכיל ליטר אחד של תמיסת קרדיו-plegic קרה טרייה בארון biosafety. השתמש אזמלים סטריליים נשלפים לנתח את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי ולהשתמש סכיני גילוח מלבניים לחתוך את החדר השמאלי לתוך אחד עד שני קוביות סנטימטר בלוקים.
מניחים בצד בלוק רקמה אחד לחיתוך ומניחים את חתיכות בלוק הרקמה הנותרות לתוך צינור 50 מיליליטר של פתרון טירודה קר על קרח. לעסות בעדינות את בלוק הרקמה השמור ולהוסיף אחת עד שתי טיפות של דבק רקמות למחזיק דגימת המתכת של הרטט. תקע חתיכה של בלוק 4%agar עם שטח פנים של כ סנטימטר מרובע אחד להדביק ולהוסיף אחת עד שתי טיפות של דבק רקמה אגר.
חבר את בלוק הלב לצד אפיקארדיום לב אגר למטה עם הרקמה שטוחה נגד המחזיק ככל האפשר ולהמקם את מחזיק הרקמה עם בלוק הלב לתוך האמבטיה חיתוך של הרטט. זה חיוני כדי לתקוע את בלוק הלב אל אגר עם הצד אפיארדיום לב פונה כלפי מטה על דבק הרקמה כדי לוודא את הרקמה היא שטוחה ככל האפשר. לאחר מכן חבר את צינור החמצן לאמבט החותך ואת מגש המתכת המלא בתסכת טירודה והצב 40 מסנני תאים מיקרומטר על מגש המתכת כדי לאסוף את חלקי רקמת הלב כפי שהם פרוסים.
השתמש בתוכנת ההפעלה vibratome כדי להתאים את גובה הלהב ואת המדגם, כך הלהב קרוב לראש הרקמה אבל מתחת לשרירים papillary ונוזל מכסה את הרקמה ואת הלהב. בחר מראש כדי להתאים היכן להתחיל חיתוך הרקמה. לחץ על פרוסה כדי להגביר את המהירות ולהשתמש ידית כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה.
לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולהתקדם כדי לבטל את הפעלת התהליך. לאחר מכן להתאים את הפרמטרים חיתוך כפי שצוין ולחץ על פרוסה כדי להתחיל לחתוך את הרקמה. כאשר הלהב מגיע לקצה הרקמה אך לפני שהוא פוגע בקצה מחזיק הדגימה, לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולחץ לחזור למצב ההתחלה.
כאשר הפרוסות מגיעות לאורך מלא נראה באיכות טובה, להשתמש פיפטה פסטר פלסטיק מלא פתרון טירודה קר לאסוף בעדינות את הרקמה מהאמבטיה באמצעות מדפים ומספריים האביב כדי לנטרל את הפרוסה מהלב לפי הצורך. מניחים כל פרוסה שנאסף מסננת תא יחיד באמבט Tyrode מחומצן ולהשתמש בתסגם פיפטה ללחוץ על הרקמה על פני מסננת התא. ואז למקם מכונת כביסה מתכת על החלק העליון של הרקמה להחזיק אותו.
לאחר שעה אחת לפחות בתסרון Tyrode מחומצן, לקצץ את החלק החיצוני של כל פרוסה כדי להסיר את כל הקצוות אחידים להדביק את הקצה של כל פרוסה על חתיכה ברוחב שישה מילימטר של חגורת תזמון מדפסת פוליאוריתן מעוקרת עם חוטי מתכת מוטבעים. מניחים את פרוסות הלב הנתמכות לתוך שש בארות צלחות המכילות שישה מיליליטר של תרבות בינונית לבא ולהשתמש ממטרים סטריליים כדי לוודא כי הרקמה היא במרכז באר. יש לדאוג כי כיסוי הצלחת לא לגעת ברקמה ולה מניח את הצלחת על צלחת התרבות, כך הצד המעוקל של כיסוי הצלחת תואם עם הצד הזוויתי של הצלחת ואת הפינות המרובעות בשורה.
מניחים את הפרוסות לתוך 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור. החלף את על-טבעי התרבות בשישה מיליליטר של תרבות מחומצנת טרייה שלוש פעמים ביום. חבר את הכיסוי לגירוי החשמלי של תרבות התאים והתאם את המגרר כדי לספק באופן רציף 10 וולט חשמל ותדר הרץ 1.2 לפרוסות הלב.
לאחר חיבור הגירוי, פרוסות הלב יתחילו לפעום. כל יום במהלך שינוי התקשורת בצהריים, להחליף את כיסוי צלחת גירוי מצלחת התרבות כדי למנוע שחרור של חלקיקי גרפיט רעילים לתוך מדיום התרבות. הכנס את תקע הקצף הלבן שבו הכיסוי המשמש מתחבר לכבל עבור מגרה חשמלי תרבות התא כדי למנוע נזקי מים למעגל החשמלי ולמקם את כיסוי הצלחת לתוך אמבטיה של מים autoclaved בתוספת 2X אנטיביוטי / אנטימיקוטי.
למחרת, לטהר את כיסוי הצלחת באמבט אתנול 70% במשך חמש עד 15 דקות לפני העברת הכיסוי לתוך אמבט מים autoclaved טרי בתוספת אנטיביוטיקה 2X / antimycotic במשך שלוש דקות. לאחר שטיפה של כיסוי הצלחת, השתמשו בניגוב נקי ללא מוך מרוסס באתנול כדי להסיר את כל שאריות המים מחלקי הפלסטיק ולהסיר את תקע הקצף הלבן. לאחר מכן העטיפה מוכנה להצבה חזרה לצלחת התרבות.
באמצעות התקנה זו תרבות ביומימטית חדשה כפי שהודגם, הכדאיות פרוסות לב חזיר נשמר במשך שישה ימים כפי שהוערך על ידי MTT assay. בששת הימים הראשונים, בדומה לתגובות שנצפו לפרוסות לב טריות, אין ארעי סידן ספונטניים בתוך לב החזיר פרוסת קרדיומיוציטים. הקרדיומיוציטים הגיבו לגירוי חשמלי ובטא-אדרנרגי חיצוני.
בנוסף, הכוח מתכווץ ותגובות isoproterenol נשמרו בתרבות פרוסת הלב עד שישה ימים דומים לזה שנצפה פרוסות לב טריות. ניתן לבצע מספר הערכות מבניות ותפקודיות על פרוסות הלב, כולל בדיקות כדאיות MTT, כשל חיסוני, מיקרוסקופ אלקטרונים, מדידות סידן ארעיות, הערכות תפקודית מתכווצים, הערכות מטבוליות וניתוח. אנו משתמשים כעת במערכת תרבות זו כדי לבדוק את רעילות לב חריפה ויעילות של תרופות וטיפולים גנטיים של עניין חזיר ופרוסות לב אנושי.
