פרוטוקול זה מדגים צלחת תרבית תאים מיקרומרקמית שתוכננה לגידול של מאות אורגנואידים בעלי ידע בחומר והתאמה מלאה למיקרוסקופיה. הטכניקה שלנו מאפשרת ביעילות לייצר אלפי אורגנואידים, בהתאמה מלאה לדימות ארוך טווח ולתרבית תאים לטווח ארוך. פרוטוקול זה הוא בעל עניין רב עבור יישומים ביו-רפואיים כגון צנרת סינון תרופות ותחומי מחקר הסרטן.
קל לשלוט בטכניקה המוצגת בפרוטוקול זה לאחר מספר ניסיונות של כל מי שיש לו ניסיון עם הליכי מעבדה ומיקרוסקופ אופטי. כדי להתחיל, לחתוך חלקים קטנים של תבנית PDMS לממד הדרוש עבור המכשיר הסופי. חותכים אותם במקביל לכיווני XY של המערך.
הניחו את אחת הקוביות המוכנות של תבנית PDMS עם הפנים כלפי מטה על החלק השטוח של PDMS. לאחר מכן באמצעות פיפטה, להוסיף כ 0.1 עד 0.2 מיליליטר של דבק UV לריפוי בצד אחד של התבנית. עקבו אחר התקדמות הנוזל בתוך החלל באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך בהגדלה של פי 10.
חשוף את הדבק לאור UV כדי לרפא אותו. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור UV כמתואר בכתב היד של הטקסט. בעזרת הכמות העודפת של הדבק בקצה אחד, החזיקו את הדבק שנרפא על מצע PDMS השטוח על ידי לחיצה עדינה עליו עם אצבע.
בינתיים, בעזרת פינצטה, צבטו פינה אחת של התבנית ליד אותו קצה המוחזק כלפי מטה וקילפו לאט את התבנית, תוך הקפדה על כך שהסרט בעל המרקם לא מורם. חתכו את עודפי הדבק ואת מצע ה-PDMS באמצעות סכין גילוח כדי להשאיר את שכבת הדבק, המרקם והדבק שטוחה על ה-PDMS עם המצע העודף בקצה אחד בלבד. טפל בכיסוי נקי עם תהליך פלזמה חמצן קצר כדי לשפר את ההידרופיליות שלו.
לאחר הפעלת הפלזמה, יש לצפות את השכבה הדקה של דבק UV הניתן לריפוי על ידי הנחת הכיסוי על צ'אק הוואקום של מעיל ספין סטנדרטי ולשפוך טיפה קטנה של דבק במרכז הכיסוי. הפעל את תהליך ציפוי הספין כמתואר בכתב היד של הטקסט. אם ציפוי הסחרור אינו זמין, יש לטפטף כ-0.1 מיליליטר של דבק UV הניתן לריפוי על כיסוי נקי באמצעות פיפטה.
קחו את הכיסוי השני והניחו אותו על גבי הראשון כדי שהדבק הנוזלי יתפזר באופן שווה בין שני הכיסויים. לאחר שהדבק הגיע לקצה הכיסויים, הפרידו ביניהם בעדינות על ידי החלקה אחד על השני. לאחר ההפרדה, שתי הכיסויים יהיו מצופות במלואן בשכבה דקה של דבק נוזלי.
לאחר ציפוי סחרור, לרפא מראש את הדבק על ידי חשיפה UV. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV בו נעשה שימוש. קחו את אחד הסרטים בעלי המרקם והניחו אותו במגע עם הכיסוי המצופה בדבק. יש לוודא שהמגע בין הדבק שנרפא חלקית לבין הסרט בעל המרקם אחיד ככל האפשר.
בשלב זה, הדבק על הכיסוי צריך להיות מוצק מספיק כדי למנוע זרימה חוזרת וניתן לייעל את המגע על ידי לחיצה עדינה על הכיסוי. יש לחשוף את הכיסויים לאור UV עד לריפוי מלא של שכבת הדבק המצופה עד לריפוי מלא. פעולה זו תאטום את היריעה בעלת המרקם על הכיסוי ותספק בידוד חסין נזילות בין החללים ההיקפיים.
לאחר מכן בעזרת פינצטה, צבטו את ה-PDMS בקצה שבו נותר החומר העודף לאחר החיתוך וקילפו את המצע השטוח PDMS. שלב זה מאפשר לשכבת סרט הצילום בעלת המרקם להיצמד למכסה עם גישה פתוחה בחלק העליון לזריעת תאים. לפני זריעת תאים, במכשיר פסיבי עם קופולימר ביומטרי כמתואר בכתב היד, יש לפזר מיליליטר אחד של PBS סטרילי לתוך צלחות פטרי תרבית תאים 35 מילימטר.
דגה את המנה עם PBS סטרילי באמצעות תא ואקום במשך 10 דקות, ולאחר מכן כמה סבבים של pipetting כדי להסיר את כל הבועות. החליפו את PBS במדיום תרבית סטרילית ועיקרו את הצלחת באור UV למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים. הכן תרחיף תאים על ידי ביצוע המלצות להכנת טריפסיניזציה או תרחיף תאים עבור התאים המעניינים כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לספור ולהתאים את ריכוז התא ל 500, 000 תאים למיליליטר בתווך תרבית התא המומלץ. הסר את מאגר PBS מצלחת תרבית התאים בקוטר 35 מ"מ ולאחר מכן הוצא מיליליטר אחד של מתלה התאים המותאם. מחזירים את צלחת תרבית התאים לאינקובטור התא למשך 10 דקות.
כ-80 עד 100 תאים ייכנסו לכל חלל היקפי. לאחר כ-10 דקות של דגירה, משחזרים את צלחת תרבית התאים מהאינקובטור ושאפו בעדינות את התרחיף התאי כדי להסיר תאים לא לכודים. מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום תרבית לצלחת התרבית ומחזירים אותו לאינקובטור התא.
לחלופין, כדי לשלוף את האורגנואידים לאחר שגדלו בבארות, צבטו את שכבת הדבק בעלת המרקם בקצה החתוך באמצעות פינצטה וקילפו אותה בעדינות מכיסוי הזכוכית, אך השאירו אותה שקועה בתווך. הגדלת ריכוז הקופולימר הביומטרי הגדילה את עובי הציפוי. פירוק מלא של צלחות תרבית התאים היה חיוני כדי להסיר בועות אוויר הכלואות בחללים ההיקפיים.
אורגנואידים נוצרו לאחר ימים שניים ו -15 של תרבית. המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב הראה תמונות מייצגות של האורגנואידים ושחזור תלת ממדי. בעת הכנת צלחת התרבית, חשוב לשים לב להרכבת התבנית או ערימת המצע ולהבטיח מגע טוב בין הסרט בעל המרקם לבין הכיסוי.
ההכלה המסופקת על ידי חללי המיקרו שלנו והיעדר אובדן חומרים משכו את תשומת ליבם של חוקרי ביולוגיה של החלל המעוניינים לחקור את השפעת המיקרו-כבידה על הומאוסטזיס אורגנואידים.
