אנו מודים לסנטיאגו סוארז לקריאה ביקורתית של כתב היד ובטי קאוגיל לסיוע בצילום. אנו מודים גם מבקרים האנונימיים על המשוב הביקורתי שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר לאוניברסיטת דלאוור.

1. הכנת protamine סולפט (PS) מצופה צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% מסולפט protamine (PS) על ידי הוספת 0.5 גרם של PS ל50 מיליליטר מים deionized, מזוקקים (DDH 2 O) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לנער היטב במהירות גבוהה על שייקר ספסל בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות כדי להבטיח פירוק של PS מלא. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 חודשים (הקפד לפזר משקע כמו ג&#39;ל לגמרי לפני כל שימוש) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השרוול של צלחות פטרי קלקר x 15 מ&quot;מ 60 מ&quot;מ ולהניח את שני מכסים ובתחתית על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1% פתרון נ.ב. בכל מנה (יכולים לשמש גם תחתית ומכסים) רק מספיק כדי לכסות את פני השטח, להשאיר למשך לפחות 2 דקות. פתרון PS השאריות ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות תוך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שטופלה PS מנות בכוס מלאה במים מזוקקים (DH 2 O). השאר את הכוס תחת זרם DH 2 O לפחות10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להשתמש בו מנות מצופים נ.ב. מייד או אוויר יבש לאחסון. לכסות אותם כדי למנוע הצטברות אבק. הם יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך 1 חודש 3. </li></ol> 2. השג תאי המין של קיפוד ים ולשתק את הביצים על צלחת מצופה נ.ב. לMicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיפודי ים שרצים על ידי טלטול או הזרקת intracoelomic של עד 1 מיליליטר של .0.5% KCl כדי לגרום להתכווצות של שרירים חלקים כדי לשחרר תאי רבייה 3 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים הוא גברי, כפי שצוין על ידי הזרע בצבע הלבן, לאסוף יבש זרע מפני שטח של בעלי חיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. זרע יבש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של תפקוד ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים הוא נקבה, כפי שצוינה על ידי הצבע הצהוב בשל תוכן חלמון הביצה, לאסוף תאי הרבייה שלה על ידי טבילת gonopores בכוס מלאה במי ים. הביצים תשוחרר מgonopores ולהתיישב על ידי כוח הכבידה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הביצים מפסולת כגון עמוד השדרה של בעלי חיים באמצעות 80 מסנן רשת ניילון מיקרומטר. התוצאות הטובות ביותר מושגות אם הביצים נמצאות בשימוש בתוך 5-7 שעות לאחר ההשרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dejelly ביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מי ים חומצי 100 מיליליטר כ 1 מיליליטר של ביצה. השתמש בחומצת לימון 0.5 M כדי להתאים את pH של מי ים מpH 8.0 ל5.1-5.2. נמוך מדי של pH יקטן הפריה וגבוהה מדי של ה-pH לא יאפשר ביצים לצרף צלחות נ.ב. מצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הביצים (יותר מ 1 מיליליטר לא) למים ים חומצי ולאפשר את הביצים להתיישב על קרח דק 10. לחלופין, הסרת מעיל הריבה ניתן להקל על ידי מתערבל עדין של הביצים בזמן הטיפול. אחד יכול למעשה dejelly ביצי purpuratus ס ב3-4 דק &#39;בדרך זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק בזהירות את מים לים חומצי, מוסיף מים ים טריים ולתת את הביצים להתיישב על קרח שוב. ניתן לאחסן ביצי Dejellied על קרח לתקופה של עד 6 שעות ללא בעיות הפריה </li></ol></li&gt; </ol> 3. בשורה הביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון M המניה של 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) על ידי המסת 0.84 גרם של 3-AT ב10 מיליליטר של DDH 2 O. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון עובד מ&quot;מ של 3-AT ידי הוספת 50 μl של פתרון M המניה 1 50 מיליליטר של מי ים prechilled. שמור את הפתרון על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפה פיפטה (איור 3) לטיפול עדין של הביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה פיפטה הוא משך באופן ידני מmicropipettes הזכוכית (100 x OD 1.09 מ&quot;מ). החזק את micropipette בשתי הידיים מעל הלהבה הפתוחה. כזכוכית מתחילה להתמוסס, למשוך בזהירות את הקצוות של פיפטה בכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את אחד משך את פיפטה לצינורות פלסטיק (מ&quot;מ 1.14 ID), חותם חזק עם Parafilm. אורכו של הצינור צריך להיות כ 50-70 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה P20 או P200 מסונן סטרילי בסוף ההפך הצינור לצינור הזכוכית כדילשמש כחתיכת הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ סוף micropipette הזכוכית עם מספריים כדי להתאים את הקוטר של הקצה. הקוטר האופטימלי מעט עולה על הקוטר של הביצה (80 מיקרומטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 4 מיליליטר של מ&quot;מ המים ים 3-AT 1 לכל מנה מצופה PS (תחתון או מכסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פיפטה בפה, לשים את קצה P20/P200 בפה ולאבטח אותו עם השיניים. כדי לשאוב את הביצים, לשאוב ראשון כמות קטנה של מי ים. על ידי בעל טור של נוזל לפני טעינת הביצים, תהיה אחד שליטה מקסימלי על טכניקת pipetting פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה micropipette ליד הביצים ולשאוב בעדינות בכמה מאות ביצים בפיפטה. להגביל את הביצים בתוך micropipette הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת dejellied ביצים בקו ישר על צלחת בעדינות על ידי נושבת אותם מחוץ לפיפטה הפה תוך כדי התנועה את הקצה בקו ישר. בשורה הביצים ממש לפני הזריקות, בגלל בעיות הפריה עלולות להתרחש בשל prolonged חשיפה למים ים 3-AT 3. יתר על כן, דבקי קטיוני כמו PS יכולים להיות רעילים לביצים, וזה לא מומלץ לחשוף את העוברים לריאגנטים אלה לתקופות ארוכות, במיוחד אם את מעטפות ההפריה הוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך שריטה על הצלחת ליד הקו של ביצים חתרו באמצעות פיפטה מזכוכית. שריטה זה תהיה חשוב כדי לשבור את מחט הזריקה כדי להתאים את הזרימה של פתרון בהתאם לצורך. לחלופין, השריטות יכולות להתבצע לפני מזיגת מים לים 3-AT למנה. </li></ol> 4. Microinjection של zygotes קיפודי הים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תחנת microinjection. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת הזרקת Femtojet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי הזרקה באמצעות חולץ מחט. דוגמא של מחט טובה מתוארת באיור 4. הערה: לקבלת זריקות RNA, צריכים להיות pretreated נימי הזרקה כדי למנוע זיהום RNAase יום 31: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נימי הזרקה לתוך 50 חרוטי מיליליטרצינורות ולהוסיף 50 מיליליטר של מסונן מתנול / HCl (09:01). לנער היטב ולהשאיר למשך הלילה לא יותר מ10 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את מתנול / HCl ולשטוף את הנימים 2x עם מתנול המסונן באותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים מתנול ככל האפשר וLyophilize נימי לילה על מנת להבטיח הסרת מלאה מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות את נימי מחט על בעל טעינת מחט ולטעון אותו עם &lt;0.5 μl של פתרון מדגם באמצעות טיפים microloader. פתרונות לדוגמא בדרך כלל מכילים גליצרול 20%, תלוי בחומר המוזרק 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת עם ביצים חתרו על הבמה מיקרוסקופ (צריכים להיות מיושרות ביצים אנכית כאשר נצפים מבעד עיניות) ולהתמקד בביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות את המחט הועמסה על בעל microinjecting המחט ולהתאים את המיקום של המחט ליש קצה בצורה מושלמת ממוקד באמצע השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחוץ על הלחצן כדי להחיל את הלחץ המקסימאלי עבורr ניקוי מחט. פתרון צריך לבוא מתוך המחט. התאם את הלחץ במידת צורך: לחץ הזרקה צריך להיות בטווח של 90-360 hPa, עם לחץ הפיצוי על כ 1/3 מלחץ ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את זרימת הפתרון על ידי הזרקה לתוך ביצית מופרה. באמצעות micromanipulator ג&#39;ויסטיק, לכוון את קצה המחט להזרקה לביצית מופרה. כדי להקל על כניסת מחט, ליצור רעידות קלות על ידי הקשה עדינה של הבמה עם חפץ קשה כגון מברג. בולוס הזרקה להרכיב בתוך הביצה יש לראות (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בולוס ההזרקה אינו גלוי, מעט להעלות את קצה המחט מעל הביצים, לאתר את השריטה על הצלחת ולהתאים אותו להיות ממוקם באמצע השדה. לטפוח בעדינות את קצה המחט לסימן השריטה לשבור את קצה מחט הזריקה. התאם את לחצי הזרקה ופיצוי על מנת להבטיח כי בולוס ההזרקה אינו עולה על 1/5 של tהוא הקוטר של הביצה (1-2 בערב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבולוס ההזרקה מכויל, להפרות את הביצים על ידי הוספת זרע מדולל (1:1,000) או 1-2 μl של זרע. מערבבים היטב בזהירות כדי למנוע פירוק השורה של ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל זריקות מייד לאחר מעטפת ההפריה הופכת לגלויה (איור 5). תנוע לאורך הקו של ביצים חתרו שימוש בבקר הבמה ולהזריק zygotes רבים ככל האפשר על ידי תוקע אותם עם המחט נשלטת על ידי micromanipulator ג&#39;ויסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 10-15 דקות, הביצים המופרות החדש תהפוך קשוחות ולא ניתן להזריק יותר. מוציא את המאפה מהבמה ובזהירות לשאוב את הזרע במי ים 3-AT באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תתנו zygotes יבש. להוסיף במהירות במי ים prechilled טריים כדי לכסות את המנה. דגירה את העוברים ב15 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation.">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li><li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).</li><li>Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+cloned+DNA+into+the+sea+urchin+zygote+nucleus,+and+fate+of+injected+DNA.">Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA.</a> Development. 102, 287-299 (1988).</li><li>Kinsey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection.">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li><li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes.">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).</li><li>Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+secondary+head-forming+activity+of+microinjected+a+dagger+beta-catenin+mRNA+by+co-injected+spermine+and+spermidine+in+Xenopus+early+embryos.">Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos.</a> Amino Acids. 42, 791-801 (2012).</li><li>O'Meara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+bovine+zygotes:+siRNA+transfection+versus+microinjection.">Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection.</a> Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).</li><li>Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery.">Nonviral gene delivery.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).</li><li>Hiramoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+without+mitotic+apparatus+in+sea+urchin+eggs.">Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs.</a> Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).</li><li>Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 25, (1982).</li><li>Gross, J. M., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Brachyury+(T)+during+gastrulation+movements+in+the+sea+urchin+Lytechinus+variegatus.">The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus.</a> Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).</li><li>Yajima M, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomy+in+specification+of+primordial+germ+cells+and+their+passive+translocation+in+the+sea+urchin.">Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin.</a> Development. 139, 3786-3794 (2012).</li><li>Duboc, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+pattern+the+mesoderm+and+endoderm+during+development+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo.</a> Development. 137, 223-235 (2010).</li><li>Ernst, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offerings+from+an+Urchin.">Offerings from an Urchin.</a> Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).</li><li>McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+sea+urchins.">Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins.</a> Development. 138, 2639-2648 (2011).</li><li>Sodergren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+article+-+The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Roux, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation.">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li><li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs.">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li><li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B+synthesis+is+required+for+sea+urchin+oocyte+maturation.">Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation.</a> Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+modifications+at+fertilization:+regulation+of+dityrosine+crosslinking+by+transamidation.">Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation.</a> Development. 136, 1835-1847 (2009).</li><li>Shuster, C. B., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells.">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li><li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly.">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning.">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li><li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+regulatory+network+for+development.">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li><li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage.">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm.">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li><li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology.">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li><li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole.">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li><li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo.">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li><li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+oocytes,+eggs,+and+embryos.">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Microinjection הוא טכניקה רבת עוצמה להעברת טיפולים שונים כגון DNA, mRNA, חלבונים רקומביננטיים, אובדן התפקוד ורווח של חומרים כימיים פונקציה, צבעים ושילובים שלהם לביציות, עובר, ותאים של אורגניזמים שונים 1-7. עם זאת, צריכים להיות כל הזמן כמה שיקולים בחשבון בעת ​​תכנון ניסוי mi...

משלוח טיפול יעיל לשחזור הוא אחד האתגרים מתודולוגיים העיקריים לחוקרים. מספר שיטות הוקמו כדי לספק transiently פתרונות טיפול לביצים, עוברים, ותאים. שיטות אלה כוללות electroporation (המבוסס על הנקבוביות חולפות הניבו בקרום באמצעות פולסים חשמליים קצרים) 1,2, lipofection (משלוח באמצעות השילוב של יפוזומים המכיל טיפול עם הקרום) 1, הפגזת microparticle 1 (DNA הוא זירז במיקרון חלקיקים בגודל מתכת המשמשים לאחר מכן לחדור לתאים במהירות גבוהה), ותמרה (וירוס משמש ככלי מסירה של transgenes). כרגע, microinjection הוא הגישה היחידה שמחזיקה את היתרון של מתן כל פתרון עם יעילות 100% עם ריאגנטים מינימאליים. יתר על כן, פתרון זריקה אחת יכול להיות מורכב מקוקטייל מורכב של טיפולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי להצליחly microinject הביצים ועוברים ממספר רב של מינים כמו קיפודי ים 3,4, דגי זברה 5, עכבר 6, צפרדע 7, ובקר 8, כמו גם תאים בודדים בתרבית רקמת 9. זריקות לסטומרים יחיד בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר גם נערכו 10-12. השיטות הנוכחיות של microinjections מבוססות על שיטת לחץ ההזרקה שהיה בתחילה שתוארה על ידי Hiramoto 10, עם זאת, התקדמות רבה נעשתה לקראת אופטימיזציה של התהליך הזה. טכניקות microinjection מצוינות כבר תיארו במקום אחר 11, וכאן אנו מתארים באחת מהשיטות הספציפיות המשמשת כיום לmicroinject קיפודי ים (purpuratus Strongylocentrotus) ביצים מופרות חדש. במשך יותר ממאה, קיפודי ים היו 15,16 מודל ניסיון יקר ערך. קיפודי ים קשורים באופן הדוק לאבולוציונית chordates (כולל אותנו) וניתוח שלהגנום שלהם גילה כי הם מכילים את כל משפחות גנים גדולות כ17 האנושיים. הם מייצרים מספר גדול של סינכרוני פיתוח עוברים שקופים שניתן להשפיע בקלות. השימוש בקיפוד ים כאורגניזם מודל, קהילת קיפודי הים תרמה להבנתנו את תהליך ההפריה 18-21, תהליכים ביולוגיים תא 22-24, ורשתות גנים רגולטוריים (GRNs) 25-28. Microinjection לzygotes קיפודי הים דורש מספר שלבים. ראשית, את הביצים צריכה להיות משותקת לפני זריקות (שיפורט להלן). מנות Microinjection הם מצופים סולפט protamine (PS), אשר יוצר משטח חיובי טיעונים שלביצים טעונות השלילי יכולה לדבוק 3. הביצים dejellied על ידי דגירה במי ים חומצי (pH 5.15) עבור 10 דקות, ואחרי שתי שטיפות במי ים טבעיים או מים מלאכותיים ים (pH 8.0). ביצי dejellied הם חתרו בזהירות בקו ישרבאמצע הצלחת מצופה נ.ב. בנוכחות 1 מ&quot;מ 3-aminotriazole (3-AT), אשר נדרש כדי לעכב את הפעילות של ovoperoxidase שמופרש מהגרגרים בקליפת המוח של הביצה כתוצאה מההפריה 29. שלב זה חשוב כדי למנוע התקשות של מעטפת ההפריה וכדי להקל על כניסת מחט microinjection. כחלופה ל1 מ&quot;מ 3-AT, חומצת 10 מ&quot;מ paraminobenzoic (PABA) יכולה לשמש. פתרון ההזרקה הוא נטען לתוך מחט microinjection באמצעות פיפטה קצה microloading מיוחד ורכוב על בעל המצורף לmicromanipulator ויחידת לחץ (איור 1). כל מחט יכולה לשמש כדי microinject zygotes הבודד בניסויים מרובים בימים נפרדים. Microinjection יכול להתבצע ל10-15 דקות, עד zygotes להתקשות. אז zygotes נשטפים עם מי הים ותרבותי ב15 ° C. כאשר העוברים להגיע בקיעת blastula במה, הם משחררים אנזים בקיעה שמעכל רכיבים של ferמעטפת tilization 30 ולאפשר להם להתנתק באופן טבעי מהצלחת המצופה PS. במידת צורך, את העוברים ניתן עדינות מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה פה או פיפטה פסטר בעדינות על ידי נושבת מי ים על העוברים. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection יעיל ואמין של 100-400 ביצים מופרות חדש על צלחת אחת, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה עבור ניתוחים במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Inverted microscope&amp;nbsp; Axiovert 40 &amp;deg;C</td><td>Zeiss</td><td>4109431007990000</td><td>Injection microscope</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td>Load injection solution</td></tr><tr><td>Nylon filter mesh 80&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>Filter eggs to get rid of debris</td></tr><tr><td>P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02707432 or 02707430</td><td>Part of a mouth pipette</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13 374 12</td><td>Part of a mouth pipette</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing</td><td>Intramedic</td><td>PE-160</td><td>Part of a mouth pipette</td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>Attach dejellied eggs to injection dishes</td></tr><tr><td>Sea urchins &lt;em&gt;S. purpuratus&lt;/em&gt;</td><td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td><td>N/A</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sea water</td><td>any pet store</td><td>Instant Ocean</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>Injection dishes</td></tr><tr><td>Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td><td>Narishige</td><td>9124</td><td>Manipulate injection needle</td></tr><tr><td>Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td><td>Narishige</td><td>9212</td><td>Manipulate injection needle</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vertical&amp;nbsp; needle puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Pull injection needles</td></tr></tbody></table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

Microinjection לתוך תאים ועוברים הוא טכניקה נפוצה המשמשת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. בשיטה זו כמות קטנה של פתרון טיפול הוא נטען לתוך מחט microinjection המשמש להזריק פיזי תאים בודדים משותקים או עוברים. למרות הצורך בהכשרה ראשונית לביצוע הליך זה למסירת תפוקה גבוהה, microinjection מציע יעילות מרבית ומשלוח לשחזור של מגוון רחב של פתרונות לטיפול (כולל תערובות מורכבות של דגימות) לתאים, ביצים או עוברים. יישומים לmicroinjections כוללים משלוח של בונה DNA, mRNAs, חלבונים רקומביננטיים, רווח של פונקציה, ואובדן של חומרים כימיים פונקציה. צבע פלואורסצנטי או colorimetric מתווסף לפתרון המוזרק כדי לאפשר הדמיה מיידית של אספקה ​​יעילה, כמו גם כלי לנורמליזציה אמינה של כמות הפתרון נמסר. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection של z קיפודי הים 100-400ygotes בתוך 10-15 דקות.

בונה כתב ה-GFP וmCherry היתה במבחנה עיבד וmicroinjected לביצים מופרים שזה עתה. עוברים הודגרו ב15 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות (עד שלב blastula) והדמיה באמצעות מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1. הזרקה של מבני כתב לא הביאה לכל ליקויים התפתחותיים (איור 6). לכימות של אותות ניאון, רכישת תמונ...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes at JoVE.com

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  University of Delaware.  Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים. 

Video: High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Developmental Biology

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genetics

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

טכניקות מיקרו-ההטחה של דגי זברה

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב"מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג'ין

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

דג הזברה פסיפס Transgenesis להערכת רצפים Enhancer

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

שיטה לMicroinjection של

טכניקות מיקרו-ההטחה של דגי זברה