אנו מודים לסנטיאגו סוארז לקריאה ביקורתית של כתב היד ובטי קאוגיל לסיוע בצילום. אנו מודים גם מבקרים האנונימיים על המשוב הביקורתי שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר לאוניברסיטת דלאוור.

1. הכנת protamine סולפט (PS) מצופה צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% מסולפט protamine (PS) על ידי הוספת 0.5 גרם של PS ל50 מיליליטר מים deionized, מזוקקים (DDH 2 O) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. לנער היטב במהירות גבוהה על שייקר ספסל בטמפרטורת חדר למשך 1-2 שעות כדי להבטיח פירוק של PS מלא. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 חודשים (הקפד לפזר משקע כמו ג&#39;ל לגמרי לפני כל שימוש) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את השרוול של צלחות פטרי קלקר x 15 מ&quot;מ 60 מ&quot;מ ולהניח את שני מכסים ובתחתית על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 1% פתרון נ.ב. בכל מנה (יכולים לשמש גם תחתית ומכסים) רק מספיק כדי לכסות את פני השטח, להשאיר למשך לפחות 2 דקות. פתרון PS השאריות ניתן לעשות שימוש חוזר פעמים רבות תוך 3 חודשים, כאשר הם מאוחסנים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שטופלה PS מנות בכוס מלאה במים מזוקקים (DH 2 O). השאר את הכוס תחת זרם DH 2 O לפחות10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן להשתמש בו מנות מצופים נ.ב. מייד או אוויר יבש לאחסון. לכסות אותם כדי למנוע הצטברות אבק. הם יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר למשך 1 חודש 3. </li></ol> 2. השג תאי המין של קיפוד ים ולשתק את הביצים על צלחת מצופה נ.ב. לMicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיפודי ים שרצים על ידי טלטול או הזרקת intracoelomic של עד 1 מיליליטר של .0.5% KCl כדי לגרום להתכווצות של שרירים חלקים כדי לשחרר תאי רבייה 3 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים הוא גברי, כפי שצוין על ידי הזרע בצבע הלבן, לאסוף יבש זרע מפני שטח של בעלי חיים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. זרע יבש יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של תפקוד ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בעל החיים הוא נקבה, כפי שצוינה על ידי הצבע הצהוב בשל תוכן חלמון הביצה, לאסוף תאי הרבייה שלה על ידי טבילת gonopores בכוס מלאה במי ים. הביצים תשוחרר מgonopores ולהתיישב על ידי כוח הכבידה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הביצים מפסולת כגון עמוד השדרה של בעלי חיים באמצעות 80 מסנן רשת ניילון מיקרומטר. התוצאות הטובות ביותר מושגות אם הביצים נמצאות בשימוש בתוך 5-7 שעות לאחר ההשרצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dejelly ביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מי ים חומצי 100 מיליליטר כ 1 מיליליטר של ביצה. השתמש בחומצת לימון 0.5 M כדי להתאים את pH של מי ים מpH 8.0 ל5.1-5.2. נמוך מדי של pH יקטן הפריה וגבוהה מדי של ה-pH לא יאפשר ביצים לצרף צלחות נ.ב. מצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הביצים (יותר מ 1 מיליליטר לא) למים ים חומצי ולאפשר את הביצים להתיישב על קרח דק 10. לחלופין, הסרת מעיל הריבה ניתן להקל על ידי מתערבל עדין של הביצים בזמן הטיפול. אחד יכול למעשה dejelly ביצי purpuratus ס ב3-4 דק &#39;בדרך זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק בזהירות את מים לים חומצי, מוסיף מים ים טריים ולתת את הביצים להתיישב על קרח שוב. ניתן לאחסן ביצי Dejellied על קרח לתקופה של עד 6 שעות ללא בעיות הפריה </li></ol></li&gt; </ol> 3. בשורה הביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון M המניה של 3-aminotriazole (3-AT, MW = 84.08) על ידי המסת 0.84 גרם של 3-AT ב10 מיליליטר של DDH 2 O. פתרון זה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון עובד מ&quot;מ של 3-AT ידי הוספת 50 μl של פתרון M המניה 1 50 מיליליטר של מי ים prechilled. שמור את הפתרון על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפה פיפטה (איור 3) לטיפול עדין של הביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קצה פיפטה הוא משך באופן ידני מmicropipettes הזכוכית (100 x OD 1.09 מ&quot;מ). החזק את micropipette בשתי הידיים מעל הלהבה הפתוחה. כזכוכית מתחילה להתמוסס, למשוך בזהירות את הקצוות של פיפטה בכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את אחד משך את פיפטה לצינורות פלסטיק (מ&quot;מ 1.14 ID), חותם חזק עם Parafilm. אורכו של הצינור צריך להיות כ 50-70 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה P20 או P200 מסונן סטרילי בסוף ההפך הצינור לצינור הזכוכית כדילשמש כחתיכת הפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ סוף micropipette הזכוכית עם מספריים כדי להתאים את הקוטר של הקצה. הקוטר האופטימלי מעט עולה על הקוטר של הביצה (80 מיקרומטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 4 מיליליטר של מ&quot;מ המים ים 3-AT 1 לכל מנה מצופה PS (תחתון או מכסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את פיפטה בפה, לשים את קצה P20/P200 בפה ולאבטח אותו עם השיניים. כדי לשאוב את הביצים, לשאוב ראשון כמות קטנה של מי ים. על ידי בעל טור של נוזל לפני טעינת הביצים, תהיה אחד שליטה מקסימלי על טכניקת pipetting פה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את קצה micropipette ליד הביצים ולשאוב בעדינות בכמה מאות ביצים בפיפטה. להגביל את הביצים בתוך micropipette הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורת dejellied ביצים בקו ישר על צלחת בעדינות על ידי נושבת אותם מחוץ לפיפטה הפה תוך כדי התנועה את הקצה בקו ישר. בשורה הביצים ממש לפני הזריקות, בגלל בעיות הפריה עלולות להתרחש בשל prolonged חשיפה למים ים 3-AT 3. יתר על כן, דבקי קטיוני כמו PS יכולים להיות רעילים לביצים, וזה לא מומלץ לחשוף את העוברים לריאגנטים אלה לתקופות ארוכות, במיוחד אם את מעטפות ההפריה הוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך שריטה על הצלחת ליד הקו של ביצים חתרו באמצעות פיפטה מזכוכית. שריטה זה תהיה חשוב כדי לשבור את מחט הזריקה כדי להתאים את הזרימה של פתרון בהתאם לצורך. לחלופין, השריטות יכולות להתבצע לפני מזיגת מים לים 3-AT למנה. </li></ol> 4. Microinjection של zygotes קיפודי הים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תחנת microinjection. כאן אנו מתארים את השימוש במערכת הזרקת Femtojet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי הזרקה באמצעות חולץ מחט. דוגמא של מחט טובה מתוארת באיור 4. הערה: לקבלת זריקות RNA, צריכים להיות pretreated נימי הזרקה כדי למנוע זיהום RNAase יום 31: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נימי הזרקה לתוך 50 חרוטי מיליליטרצינורות ולהוסיף 50 מיליליטר של מסונן מתנול / HCl (09:01). לנער היטב ולהשאיר למשך הלילה לא יותר מ10 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את מתנול / HCl ולשטוף את הנימים 2x עם מתנול המסונן באותו הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים מתנול ככל האפשר וLyophilize נימי לילה על מנת להבטיח הסרת מלאה מתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות את נימי מחט על בעל טעינת מחט ולטעון אותו עם &lt;0.5 μl של פתרון מדגם באמצעות טיפים microloader. פתרונות לדוגמא בדרך כלל מכילים גליצרול 20%, תלוי בחומר המוזרק 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת עם ביצים חתרו על הבמה מיקרוסקופ (צריכים להיות מיושרות ביצים אנכית כאשר נצפים מבעד עיניות) ולהתמקד בביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בזהירות את המחט הועמסה על בעל microinjecting המחט ולהתאים את המיקום של המחט ליש קצה בצורה מושלמת ממוקד באמצע השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללחוץ על הלחצן כדי להחיל את הלחץ המקסימאלי עבורr ניקוי מחט. פתרון צריך לבוא מתוך המחט. התאם את הלחץ במידת צורך: לחץ הזרקה צריך להיות בטווח של 90-360 hPa, עם לחץ הפיצוי על כ 1/3 מלחץ ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את זרימת הפתרון על ידי הזרקה לתוך ביצית מופרה. באמצעות micromanipulator ג&#39;ויסטיק, לכוון את קצה המחט להזרקה לביצית מופרה. כדי להקל על כניסת מחט, ליצור רעידות קלות על ידי הקשה עדינה של הבמה עם חפץ קשה כגון מברג. בולוס הזרקה להרכיב בתוך הביצה יש לראות (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בולוס ההזרקה אינו גלוי, מעט להעלות את קצה המחט מעל הביצים, לאתר את השריטה על הצלחת ולהתאים אותו להיות ממוקם באמצע השדה. לטפוח בעדינות את קצה המחט לסימן השריטה לשבור את קצה מחט הזריקה. התאם את לחצי הזרקה ופיצוי על מנת להבטיח כי בולוס ההזרקה אינו עולה על 1/5 של tהוא הקוטר של הביצה (1-2 בערב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבולוס ההזרקה מכויל, להפרות את הביצים על ידי הוספת זרע מדולל (1:1,000) או 1-2 μl של זרע. מערבבים היטב בזהירות כדי למנוע פירוק השורה של ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל זריקות מייד לאחר מעטפת ההפריה הופכת לגלויה (איור 5). תנוע לאורך הקו של ביצים חתרו שימוש בבקר הבמה ולהזריק zygotes רבים ככל האפשר על ידי תוקע אותם עם המחט נשלטת על ידי micromanipulator ג&#39;ויסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 10-15 דקות, הביצים המופרות החדש תהפוך קשוחות ולא ניתן להזריק יותר. מוציא את המאפה מהבמה ובזהירות לשאוב את הזרע במי ים 3-AT באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תתנו zygotes יבש. להוסיף במהירות במי ים prechilled טריים כדי לכסות את המנה. דגירה את העוברים ב15 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li><li>Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Delivery+of+DNA+and+Morpholinos+into+Mouse+Preimplantation+Embryos+by+Electroporation.">Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation.</a> Plos One. 7, 13 (2012).</li><li>Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).</li><li>Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+cloned+DNA+into+the+sea+urchin+zygote+nucleus,+and+fate+of+injected+DNA.">Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA.</a> Development. 102, 287-299 (1988).</li><li>Kinsey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+signaling+pathways+in+zebrafish+development+by+microinjection.">Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection.</a> Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).</li><li>Kola, I., Sumarsono, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+in+vitro+transcribed+RNA+and+antisense+oligonucleotides+in+mouse+oocytes+and+early+embryos+to+study+the+gain-+and+loss-of-function+of+genes.">Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes.</a> Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).</li><li>Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+secondary+head-forming+activity+of+microinjected+a+dagger+beta-catenin+mRNA+by+co-injected+spermine+and+spermidine+in+Xenopus+early+embryos.">Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos.</a> Amino Acids. 42, 791-801 (2012).</li><li>O'Meara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+bovine+zygotes:+siRNA+transfection+versus+microinjection.">Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection.</a> Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).</li><li>Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery.">Nonviral gene delivery.</a> Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).</li><li>Hiramoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+division+without+mitotic+apparatus+in+sea+urchin+eggs.">Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs.</a> Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).</li><li>Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Cell Biology. 25, (1982).</li><li>Gross, J. M., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Brachyury+(T)+during+gastrulation+movements+in+the+sea+urchin+Lytechinus+variegatus.">The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus.</a> Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).</li><li>Yajima M, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomy+in+specification+of+primordial+germ+cells+and+their+passive+translocation+in+the+sea+urchin.">Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin.</a> Development. 139, 3786-3794 (2012).</li><li>Duboc, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+and+BMP2/4+pattern+the+mesoderm+and+endoderm+during+development+of+the+sea+urchin+embryo.">Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo.</a> Development. 137, 223-235 (2010).</li><li>Ernst, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Offerings+from+an+Urchin.">Offerings from an Urchin.</a> Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).</li><li>McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+crossroads+in+developmental+biology:+sea+urchins.">Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins.</a> Development. 138, 2639-2648 (2011).</li><li>Sodergren, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+article+-+The+genome+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus.">Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus.</a> Science. 314, 941-952 (2006).</li><li>Roux, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+and+proteomic+perspective+of+sea+urchin+calcium+signaling+and+egg+activation.">A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation.</a> Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).</li><li>Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+increases+the+polyphosphoinositide+content+of+sea+urchin+eggs.">Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs.</a> Nature. 310, 414-415 (1984).</li><li>Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B+synthesis+is+required+for+sea+urchin+oocyte+maturation.">Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation.</a> Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).</li><li>Wong, J. L., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+modifications+at+fertilization:+regulation+of+dityrosine+crosslinking+by+transamidation.">Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation.</a> Development. 136, 1835-1847 (2009).</li><li>Shuster, C. B., Burgess, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+regulating+the+timing+of+cytokinesis+in+embryonic+cells.">Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells.</a> Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).</li><li>Morris, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytoskeletal+and+motility+proteins+in+the+sea+urchin+genome+assembly.">Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly.</a> Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Cell+Geometry+on+Division-Plane+Positioning.">Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning.</a> Cell. 144, 414-426 (2011).</li><li>Davidson, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+regulatory+network+for+development.">A genomic regulatory network for development.</a> Science. 295, 1669-1678 (2002).</li><li>Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+regulatory+logic+for+specification+of+an+embryonic+cell+lineage.">Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).</li><li>Peter, I. S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+controlling+the+embryonic+specification+of+endoderm.">A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm.</a> Nature. 474, (2011).</li><li>Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cis-regulatory+genomics+for+systems+biology.">Functional cis-regulatory genomics for systems biology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).</li><li>Showman, R. M., Foerder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+fertilization+membrane+of+sea-urchin+embryos+employing+aminotriazole.">Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole.</a> Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).</li><li>Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+expression+of+the+hatching+enzyme+gene+in+the+sea-urchin+embryo.">Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo.</a> Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).</li><li>Jaffe, L. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microinjection+of+oocytes,+eggs,+and+embryos.">Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos.</a> Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

Microinjection הוא טכניקה רבת עוצמה להעברת טיפולים שונים כגון DNA, mRNA, חלבונים רקומביננטיים, אובדן התפקוד ורווח של חומרים כימיים פונקציה, צבעים ושילובים שלהם לביציות, עובר, ותאים של אורגניזמים שונים 1-7. עם זאת, צריכים להיות כל הזמן כמה שיקולים בחשבון בעת ​​תכנון ניסוי microinjection. זה חשוב מאוד לקחת בחשבון את המסיסות של הטיפול נמסר ואת עוצמת הזריקה. אם פתרון microinjected נוטה ליצור אפילו משקע קל, מחט microinjecting תהיה סתומה. באופן כללי מומלץ לצנטריפוגה הפתרון ליותר מ -15 דקות לפני הטעינה לתוך המחט לוודא כל משקע הוא להסיר את הפתרון 3. הגישה אחרת היא להעביר את הפתרון באמצעות עמודות ספין Millipore. אם זה לא אפשרי, כדי למנוע סתימה, יתכן שניתן יהיה לפתוח סתימת המחט על ידי עדין שבירת הקצה שוב,אבל זה הופך להיות קשה לשלוט על זרימת הפתרון, אם הקצה הוא רחב מדי. הכמות הגדולה של הפתרון המוזרק יכולה להיות רעילה לעובר, ומעבר לקצה הרחב מציג וריאציות גדולות יותר בין הנפחים של תמיסה מוזרקים לעוברי אדם. כמו כן, חשוב שכמות הנפח מוזרק לביציות המופרות החדש מותאמת. הנפח המוזרק יכול להיות מכויל על ידי משיכת המחטים בהגדרות שונות המיושמת על ידי הזרקת התמיסה לתוך שמן. זה מאפשר מדידת הקוטר (ולכן הנפח) של רביב 32. אנו מוצאים כי כמות מקובלת של פתרון הזרקה בביצית מופרה החדש שלא תעלה על 1/5 בקוטר של הביצית המופרית, כפי שמוצג באיור 5. העצה העיקרית היא לטעון את המחט ממש לפני ההזרקה, לעבודה מהירה, ולעתים קרובות כדי להשתמש בפונקצית כפתור ניקוי של מזרק אשר מפעיל יישום של הלחץ זמין המרבי ללשקע בכדי לשטוף את מחט הזריקה החסומה. לפעמים המחט עלולה לסתום מבחוץ, כאשר הזרע והפסולת מן הביצים מוזרקות בעבר להיצמד לקצה המחט. במקרה זה, כדאי להעלות את המחט כל הדרך עד ממי 3-AT בצלחת הזרקה. בדרך כלל את המתח שנגרם על ידי הממשק נוזל האוויר הוא מספיק כדי להסיר את הפסולת. לחלופין, בעדינות לצחצח את מחט הזריקה נגד השריטה על צלחת ההזרקה עשוי לעזור גם. במקרה הקיצוני, ניתן לנגב את קצה המחט עם Kimwipe הרטוב המטפטף. עם זאת, מנגב כזו מחייב זהירות ומעשה קיצוניים. צבעי ניאון כגון 10,000 יזין האדום MW טקסס הואשמו dextran (2 מ&quot;ג / מיליליטר) לייצר אות חזקה שניתן לאתרם ומשמש לנורמליזציה אמינה של הפתרון המוזרק. כאשר ה-mRNA הוא להיות מוזרקת, מומלץ לcoinject עם mCherry או GFP mRNAs יחד עם ה-mRNA של בterest כדי לוודא ששום השפלה mRNA התקיימה. במקרה זה הדמיה של אות הניאון תלויה בתרגום של mCherry או ה-GFP. אם השימוש בצבעי ניאון או מבנים אינו אפשרי, מומלץ לחתור כמות קטנה של ביצים על כל מנה בודדת על מנת לוודא כי כל הביצים מופרות החדש על המנה שמוזרקות. לסיכום, microinjection הוא כלי רב ערך למחקר בגנטיקה, ביולוגיה מולקולרית, תאית, והתפתחותית. באמצעות טכניקה זו, הקהילה של קיפוד הים הפכה תרומה משמעותית להבנה של תא וביולוגיה התפתחותית כגון מפרט גורל תא, תפקוד גן, ויסות הגנים ומסלולים ביוכימיים התפתחות עוברית בסיסית 16 שלנו.

משלוח טיפול יעיל לשחזור הוא אחד האתגרים מתודולוגיים העיקריים לחוקרים. מספר שיטות הוקמו כדי לספק transiently פתרונות טיפול לביצים, עוברים, ותאים. שיטות אלה כוללות electroporation (המבוסס על הנקבוביות חולפות הניבו בקרום באמצעות פולסים חשמליים קצרים) 1,2, lipofection (משלוח באמצעות השילוב של יפוזומים המכיל טיפול עם הקרום) 1, הפגזת microparticle 1 (DNA הוא זירז במיקרון חלקיקים בגודל מתכת המשמשים לאחר מכן לחדור לתאים במהירות גבוהה), ותמרה (וירוס משמש ככלי מסירה של transgenes). כרגע, microinjection הוא הגישה היחידה שמחזיקה את היתרון של מתן כל פתרון עם יעילות 100% עם ריאגנטים מינימאליים. יתר על כן, פתרון זריקה אחת יכול להיות מורכב מקוקטייל מורכב של טיפולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי להצליחly microinject הביצים ועוברים ממספר רב של מינים כמו קיפודי ים 3,4, דגי זברה 5, עכבר 6, צפרדע 7, ובקר 8, כמו גם תאים בודדים בתרבית רקמת 9. זריקות לסטומרים יחיד בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר גם נערכו 10-12. השיטות הנוכחיות של microinjections מבוססות על שיטת לחץ ההזרקה שהיה בתחילה שתוארה על ידי Hiramoto 10, עם זאת, התקדמות רבה נעשתה לקראת אופטימיזציה של התהליך הזה. טכניקות microinjection מצוינות כבר תיארו במקום אחר 11, וכאן אנו מתארים באחת מהשיטות הספציפיות המשמשת כיום לmicroinject קיפודי ים (purpuratus Strongylocentrotus) ביצים מופרות חדש. במשך יותר ממאה, קיפודי ים היו 15,16 מודל ניסיון יקר ערך. קיפודי ים קשורים באופן הדוק לאבולוציונית chordates (כולל אותנו) וניתוח שלהגנום שלהם גילה כי הם מכילים את כל משפחות גנים גדולות כ17 האנושיים. הם מייצרים מספר גדול של סינכרוני פיתוח עוברים שקופים שניתן להשפיע בקלות. השימוש בקיפוד ים כאורגניזם מודל, קהילת קיפודי הים תרמה להבנתנו את תהליך ההפריה 18-21, תהליכים ביולוגיים תא 22-24, ורשתות גנים רגולטוריים (GRNs) 25-28. Microinjection לzygotes קיפודי הים דורש מספר שלבים. ראשית, את הביצים צריכה להיות משותקת לפני זריקות (שיפורט להלן). מנות Microinjection הם מצופים סולפט protamine (PS), אשר יוצר משטח חיובי טיעונים שלביצים טעונות השלילי יכולה לדבוק 3. הביצים dejellied על ידי דגירה במי ים חומצי (pH 5.15) עבור 10 דקות, ואחרי שתי שטיפות במי ים טבעיים או מים מלאכותיים ים (pH 8.0). ביצי dejellied הם חתרו בזהירות בקו ישרבאמצע הצלחת מצופה נ.ב. בנוכחות 1 מ&quot;מ 3-aminotriazole (3-AT), אשר נדרש כדי לעכב את הפעילות של ovoperoxidase שמופרש מהגרגרים בקליפת המוח של הביצה כתוצאה מההפריה 29. שלב זה חשוב כדי למנוע התקשות של מעטפת ההפריה וכדי להקל על כניסת מחט microinjection. כחלופה ל1 מ&quot;מ 3-AT, חומצת 10 מ&quot;מ paraminobenzoic (PABA) יכולה לשמש. פתרון ההזרקה הוא נטען לתוך מחט microinjection באמצעות פיפטה קצה microloading מיוחד ורכוב על בעל המצורף לmicromanipulator ויחידת לחץ (איור 1). כל מחט יכולה לשמש כדי microinject zygotes הבודד בניסויים מרובים בימים נפרדים. Microinjection יכול להתבצע ל10-15 דקות, עד zygotes להתקשות. אז zygotes נשטפים עם מי הים ותרבותי ב15 ° C. כאשר העוברים להגיע בקיעת blastula במה, הם משחררים אנזים בקיעה שמעכל רכיבים של ferמעטפת tilization 30 ולאפשר להם להתנתק באופן טבעי מהצלחת המצופה PS. במידת צורך, את העוברים ניתן עדינות מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה פה או פיפטה פסטר בעדינות על ידי נושבת מי ים על העוברים. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection יעיל ואמין של 100-400 ביצים מופרות חדש על צלחת אחת, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה עבור ניתוחים במורד הזרם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="794">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass pasteur pipettes</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:211px;">14673-043</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope Axiovert 40C</td>
			<td style="width:200px;">Zeiss</td>
			<td style="width:211px;">4109431007990000</td>
			<td>Injection microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader tips</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:211px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;">Load injection solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nylon filter mesh 80 &#956;m</td>
			<td style="width:200px;">Amazon.com</td>
			<td style="width:211px;">03-80-37</td>
			<td style="width:167px;">Filter eggs to get rid of debris</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">02707432 or 02707430</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13 374 12</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:200px;">Intramedic</td>
			<td style="width:211px;">PE-160</td>
			<td style="width:167px;">Part of a mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Protamine sulfate</td>
			<td style="width:200px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td style="width:211px;">194729</td>
			<td style="width:167px;">Attach dejellied eggs to injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea urchins S. purpuratus</td>
			<td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td>
			<td style="width:211px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sea water</td>
			<td style="width:200px;">any pet store</td>
			<td style="width:211px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">0875713A</td>
			<td style="width:167px;">Injection dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9124</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND</td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">9212</td>
			<td>Manipulate injection needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfer pipettes</td>
			<td style="width:200px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">13-711-9AM</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical needle puller </td>
			<td style="width:200px;">Narishige</td>
			<td style="width:211px;">PC-10</td>
			<td>Pull injection needles</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput microinjections of sea urchin zygotes

Microinjection לתוך תאים ועוברים הוא טכניקה נפוצה המשמשת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. בשיטה זו כמות קטנה של פתרון טיפול הוא נטען לתוך מחט microinjection המשמש להזריק פיזי תאים בודדים משותקים או עוברים. למרות הצורך בהכשרה ראשונית לביצוע הליך זה למסירת תפוקה גבוהה, microinjection מציע יעילות מרבית ומשלוח לשחזור של מגוון רחב של פתרונות לטיפול (כולל תערובות מורכבות של דגימות) לתאים, ביצים או עוברים. יישומים לmicroinjections כוללים משלוח של בונה DNA, mRNAs, חלבונים רקומביננטיים, רווח של פונקציה, ואובדן של חומרים כימיים פונקציה. צבע פלואורסצנטי או colorimetric מתווסף לפתרון המוזרק כדי לאפשר הדמיה מיידית של אספקה ​​יעילה, כמו גם כלי לנורמליזציה אמינה של כמות הפתרון נמסר. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection של z קיפודי הים 100-400ygotes בתוך 10-15 דקות.

בונה כתב ה-GFP וmCherry היתה במבחנה עיבד וmicroinjected לביצים מופרים שזה עתה. עוברים הודגרו ב15 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות (עד שלב blastula) והדמיה באמצעות מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1. הזרקה של מבני כתב לא הביאה לכל ליקויים התפתחותיים (איור 6). לכימות של אותות ניאון, רכישת תמונה בוצעה בהגדלה נמוכה (100X) כדי ללכוד מקסימאלי פיקסלים ניאון (איורים 6D-F). אותות ניאון היו לכמת באמצעות AxioVision 4.8.2.0. סטיות ההתקן לעוצמת אותות ניאון בתוך האוכלוסייה של 100-200 blastulae לא יעלו על 1.5% (מידע לא מוצג). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig1.jpg" /> איור 1. התקנת microinjection. () Di מצופה PSsh עם ביצים משותקים ממוקם על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה (ב &#39;). מחט Microinjection מחוברת לבעל מחט שמחובר ליחידת לחץ (ד) (ג). תנועה בx-,-ממדי z-Y, והיא נוהלה עם השימוש (E) micromanipulator או (F) מניפולטור הגס. (G) מברג עטוף במגבות נייר משמש כדי לנצל את הבמה מיקרוסקופ בעדינות כדי לגרום לרעידות קלות כדי להקל על כניסת מחט לתוך הביצית המופרית החדש. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig2.jpg" /> איור 2. השרצה של קיפודי הים. () קיפודי ים מושרה לשפוך על ידי הזרקת intracoelomic של .0.5% KCl. נקודות מחט קרום peristomial המקיף את פיו של בעל החיים, החלק הרך בלבד של בעלי החיים.(ב) קיפודי ים נקבה ממוקם עם gonapores השקוע במי הים בכוס פלסטיק לאסוף ביצים צהובות. (ג) זרע לבן הוא שוחרר מgonapores של קיפודי ים ממין הזכר. <img alt="איור 3" fo:content-width="4.25in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig3.jpg" /> איור 3. . פיפטה בפה פיפטה בפה מורכבת משלושה חלקים: (א) מחט micropipette זכוכית, (ב) צינורות פלסטיק, וP20 המסונן סטרילי או טיפ P200 (C). Micropipette הזכוכית מוכנס לתוך צינורות הפלסטיק שמחובר לP20 או חתיכת הפה P200. <img alt="איור 4" fo:content-width="4.25in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig4.jpg" /> איור 4. מחט microinjection. () מחט microinjection היא pulהוביל באמצעות חולץ מחט עם הגדרה ספציפית. ההגדרה של חולץ המחט צריכה להיקבע באופן אמפירי. שימוש Narishege חולץ מחט PC-10, אנו משתמשים 72.8 מעלות צלזיוס במשך חום הגדרת 1 ו83.7 מעלות צלזיוס במשך חום הגדרת 2. שימוש בשריטה על צלחתנו לשבור את קצה המחט כדי להקל על זרימת פתרון. (ב) מחט טובה צריכה באורך של 500-600 מיקרומטר מרוחב של 50 מיקרומטר בכתף עד 5 מיקרומטר בקצה. <img alt="איור 5" fo:content-width="4.25in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig5.jpg" /> איור 5. הזרקה של ביצי קיפודי ים שהופרו זה עתה. ביצי Dejellied היו חתרו על צלחת מצופה PS ומופרה. ביצים מופרות שזה עתה הוזרקו אחד אחד תוך הזזת הבמה מיקרוסקופ לאורך קו zygotes (מלמעלה למטה). () בולוס הזרקה בבירור לראות כדי להרכיב בתוך מופרה החדשביצה בקצה המחט. (ב) מעטפת הפריה שקופה נוצר על הפריה. זרע (C) מופיע נקודות שחורות קטנות כמו ברקע. בר סולם הוא 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50841/50841fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig6.jpg" /> איור 6. zygotes microinjected התפתח blastulae ללא פגמים התפתחותיים או מורפולוגי. ביצים מופרות חדש הוזרקו סמני ניאון המאפשרים להם להבחין בין עוברי uninjected (המוצגים על ידי חצים) באופן ברור. (AC) עוברים צילם בהגדלה 400X. (DF) עוברים הם צילמו בהגדלה 100X כדי ללכוד את רוב אותות הקרינה הנפלטים לכימות אמין. לאחר 24 עמ &#39;שעהההפריה OST, blastulae נאסף וטופלה במי ים 2x למשך 2 דקות כדי לשתק את עוברי שחייה 3, ואחריו 1x לשטוף במי ים. תמונות שנרכשו עם מיקרוסקופ Zeiss אובזרוור Z1 והמצלמה monochromic AxioCam. (A, D) תמונות של דסק&quot;ש blastulae. (B, E) תמונות של שכבות של עוברים הוזרקו במבחנה עיבד mCherry בקרינה וערוצי דסק&quot;ש. (C, F) תמונות של שכבות של עוברים הוזרקו במבחנה עיבד ה-GFP בקרינה וערוצי דסק&quot;ש. בר סולם הוא 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50841/50841fig6highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes at JoVE.com

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

high-throughput-microinjections-of-sea-urchin-zygotes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Views.  University of Delaware.  Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים. 

Video: High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

טיהור הזרימה Cytometry מבוסס<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; זיגוטות

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

שיטה לMicroinjection של<em&gt; Minata Patiria</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...