המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר סטיב Withers ו הונג מינג חן למתן DNP-Cellobioside המצע.

לפני שמתחילים בפרוטוקול זה, יהיה עליך בספרייה metagenomic שלך מאוחסנים בתבנית 384 צלחת היטב. במחקר שלנו, השתמשנו pCC1 לשלוט עותק וקטור fosmid בשילוב עם TransforMax phage T1 עמידים EPI300 T1-R א coli תאים כמארח הספרייה ומאוחסנים הצלחות שלנו ב -80 ° C 11. 1. שכפול של פלטות ספריית Metagenomic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו צלחות המכיל את הספרייה ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות, או עד בארות כל מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכונת אור UV לחיטוי על qPix2 כדי לעקר את הרובוט במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מרק LB עם chloramphenicol בריכוז הסופי של 12.5ug/mL ו arabinose ב 100ug/mL בבקבוק 500ml מגיב. כל צלחת ישתמשו 20mL כ, בתוספת לבצע 50 מ&quot;ל נוספים כדי לאפשר נפח מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת qFill3 כפי הוראות היצרן לכל עם בקבוק התקשורת מחוברת סעפת דרך צינורות הסטרילי. תוכנית זאת עבור הסכום המתאים של מדיה, ולהגדיר את זה כדי למלא נפח 45uL היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר את האוויר ואת צינורות סעפת באמצעות התכונה לטהר של הרובוט עד המדיה גלוי בא להצמיד לכל אחד סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המספר הרצוי של צלחות עם התקשורת LB באמצעות qFill3. צלחת לכל אורך כ 20 שניות כדי למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחות ספריה צלחות טרי לאזורים המתאימים של הרובוט qPix2. מלאו את אמבטיות ניקוי עם ריאגנטים מתאימה; 2% Micro90 באמבטיה האחורי, autoclaved מים מזוקקים באמבטיה באמצע, 80% אתנול באמבטיה הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנית &quot;שכפול&quot; של qPix2. בשנת תוכנה, בחר את הראש המתאים, מספר סוגים של פלטות מקור וצלחות היעד. גם הקים את הראש כדי לנקות בין משוכפלים, בדרך כלל 6 מחזורים באמבטיה כל זה מספיק. קיבולת של המכונה הוא 10 צלחות בכל פעם, וזה לוקח בערך 15 דקות כדי לשכפל את כולם עם ראש סיכה 384 (או כ -50 דקות עם ראש סיכה 96). הערה: אין אפשרות &quot;לבחוש מקור&quot; או &quot;מערבבים יעד&quot;. מומלץ לא להשתמש באפשרויות אלה כבעיות התרחשו בעבר עם הרובוט שלנו להשתמש בהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות משוכפלים, לגדל את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתוך קופסת לחות. כי אנחנו גרימת מספר עותק גבוהה של fosmid עם תוספת של arabinose, שיבוטים נוטים לגדול לאט יותר מאשר אי - המושרה שיבוטים. החזר את הצלחות הספריה -80 ° C. הערה: דגירה בקופסת לחות מבטיח אידוי של התקשורת אינה מתרחשת בארות בשולי הצלחות, שמירה על סביבה אחידה עבור כל בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הרובוט qFill3 ידי הראשון טיהור אותו עם מים (~ 50 מ&quot;ל) ולאחר מכן אתנול 80% (~ 50 מ&quot;ל). לפרק את הרכיבים, ונקי החיטוי את הבקבוק, מכסה, צינורות עטופים בנייר אלומיניום. </li></ol> 2. מדידת צמיחה של E. coli המשובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צלחות מ 37 ° C חממה. הסר להפריש את המכסים, וצלחות מקום על גבי פלטפורמת המגזין טוען המסופק עם RapidStak, עד מקסימום של 25 צלחות. הערה: צלחת בתחתית הערימה יהיה הראשון לקרוא. הקפד לעקוב אחר הסדר של הצלחות, כמו התוכנה אינה רשומה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחסנית אחת מן Stak המהירה, ודא הוא ריק, ו לדחוף אותו על ערימת צלחות לקרוא. תפוס אותו בידית, ולוחות צריכים להיות טעון לתוך המגזין. טען את המחסנית לתוך RapidStak. הערה: מגזין יש בורג קטן בפינה המציין אשר פינה את הבארות A1 של הצלחות צריך ללכת. המגזין רק הר של RapidStak בכיוון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית RE SkanIt במחשב המחובר למכונות. בחר &quot;הפעלה חדשה&quot; בשם כראוי. בחר &quot;קורנינג קרקעית שטוחה-384 גם צלחת&quot; כסוג צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור &quot;פריסה פלייט&quot;, בחר את &quot;אשף&quot; כפתור, לבחור בו כדי להוסיף 384 נעלמים אל הצלחת שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור &quot;פרוטוקול&quot;, בחרו באפשרות &quot;ובכן Loop&quot;, והזן עבור 384 בארות. סמל &quot;ובכן Loop&quot; יופיעו עץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחר את הסמל ולחץ כדי להוסיף &quot;מדידה photometric&quot;. הגדר אותו לקרוא 600nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור פרוטוקול שלך עם שם ייחודי, לסגור את התוכנית RE SkanIt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, פתח את התוכנית PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמוד הראשי תהיה טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים למכשיר RapidStak. VarioSkan צריך להיות בצד השמאלי של השולחן הזה. תחת הכותרת VarioSkan, יהיו שני קישורים: &quot;RunSession&quot; ו &quot;לדגור&quot;. לחץ על האפשרות &quot;RunSession&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש, החלון assay, יופיעו עם זרימה באמצע. בחר את &quot;RunSession&quot; פריט (זה צריך להיות הפריט הנוכחי בלבד). בצד ימין של המסך התפריט הנפתחיופיע. מצא את שמו של רי ששמרת SkanIt להפעיל בתפריט זה. הערה: נראה שיש לא מזמין רציונלי לתפריט הזה. זה לא אלפביתי, או לפי תאריך נוסף, או הקשורים בו במחשב פרוטוקול נשמר. זה אומר שאתה צריך להסתכל דרך כל הפרוטוקולים לפני מציאת שלך, וזה כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבחרת פרוטוקול שלך, בפינה הימנית העליונה לחץ על &quot;הפעל assay&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת יצוץ, תתבקש לציין אשר מגזין להשתמש בו כמקור, ואשר מגזין ריקה. תיבת נמוך יותר על המסך המתאים מגזין הקדמי. [אופציונלי: הוא מבקש ממך להזין את מספר צלחות עמוסות לקבוע אומדן בסכום של זמן זה ייקח. אומדן זה הוא בדרך כלל רחוק.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו גם RapidStak ואת VarioSkan מופעלים, ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RapidStak יטען אוטומטית צלחות שלך לתוך קורא את הצלחת, המאפשר מדידה רציפה של הצלחות. כדי לקרוא את 25 צלחות לוקח כ 50 דקות. הערה: מומלץ לקיים את הטעינה הראשונה לתוך צלחת VarioSkan כדי להבטיח תיאום נאות של המכונות. אם RapidStak לא להעמיס על הקורא צלחת כראוי, להשתמש &quot;זה assay השהה&quot; כפתור בפינה הימנית העליונה של חלון PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VarioSkan נעשה לקרוא את כל הצלחות, להסיר את המגזין מלא ומניחים אותו על משטח הטעינה המגזין. הרימו את המלבן החיצוני של הפלטפורמה, ומגזין צריך להחליק משם, משאיר את הלוחות עומדים בערימה באמצע. החלף את המכסים על צלחות המתאים. </li></ol> 3. הוספת מערבבים את Assay על כל צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת assay באמצעות מניות 10x premade של לערבב תמוגה (10% Triton X-100, RIS 100mm, 10mm EDTA) במאגר 50mm אצטט אשלגן ב-pH 5.5. הכינו מלאי של עד המצע DNP-cellobioside 75mg/mL ב DMSO, מוודא את המצע נמס לגמרי. הוסף DNP-cellobioside פתרון מניות לערבב assay לריכוז סופי של 0.1mg/mL. כל צלחת ישתמשו כ 20mL של פתרון, ובנוסף לעשות 50 מ&quot;ל נוספים כדי לאפשר נפח מת. הערה: DNP-Cellobioside אינו מסיס בקלות במים, כך מתמוססת DMSO מגביר את מסיסות. הנוכחות של DMSO בפתרון הסופי assay אין תופעות נצפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת qFill3 כפי הוראות היצרן לכל עם בקבוק התקשורת מחוברת סעפת דרך צינורות הסטרילי. תוכנית זאת עבור הסכום המתאים של מדיה, ולהגדיר את זה כדי למלא נפח 45uL היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר את האוויר ואת צינורות סעפת באמצעות התכונה לטהר של הרובוט עד המדיה גלוי בא להצמיד לכל אחד סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לערבב assay אל כל צלחת באמצעות qFill3. צלחת לכל אורך כ 20 שניות כדי למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לערבב assay הוא הוסיף, דגירה צלחות ב 37 ° C בקופסת לחות במשך 12-16 שעות. הערה: Over-הדגירה של צלחות פעם לערבב את assay נוסף יגרום אידוי של בארות החיצוני של הצלחת, מניב קריאות ספיגת גבוה יותר מאשר לראות את הבארות בפנים. זה יכול להיות מקוזז על ידי דוגרים צלחות בתא לחות. </li></ol> 4. ספיגת קריאה של המשובטים assayed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צלחות מ 37 ° C חממה. הסר להפריש את המכסים, וצלחות מקום על גבי פלטפורמת המגזין טוען המסופק עם RapidStak, עד מקסימום של 25 צלחות. הערה: צלחת בתחתית הערימה יהיה הראשון לקרוא. הקפד לעקוב אחר הסדר של הצלחות, כמו התוכנה אינה רשומה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחסנית אחת מן Stak המהירה, ודא הוא ריק, ו לדחוף אותו על ערימת צלחות לקרוא. תפוס אותו בידית, ולוחות צריכים להיות טעון לתוך המגזין. טען את המחסנית לתוך RapidStak. הערה: מגזין יש בורג קטן בפינה המציין אשר פינה את הבארות A1 של הצלחות צריך ללכת. המגזין רק הר של RapidStak בכיוון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית RE SkanIt במחשב המחובר למכונות. בחר &quot;הפעלה חדשה&quot; בשם כראוי. בחר &quot;קורנינג קרקעית שטוחה-384 גם צלחת&quot; כסוג צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור &quot;פריסה פלייט&quot;, בחר את &quot;אשף&quot; כפתור, לבחור בו כדי להוסיף 384 נעלמים אל הצלחת שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור &quot;פרוטוקול&quot;, בחרו באפשרות &quot;ובכן Loop&quot;, והזן עבור 384 בארות. סמל &quot;ובכן Loop&quot; יופיעו עץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחר את הסמל ולחץ כדי להוסיף &quot;מדידה photometric&quot;. הגדר אותו לקרוא 400nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור פרוטוקול שלך עם שם ייחודי, לסגור את התוכנית RE SkanIt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, פתח את התוכנית PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמוד הראשי תהיה טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים למכשיר RapidStak. VarioSkan צריך להיות בצד השמאלי של השולחן הזה. תחת הכותרת VarioSkan, יהיו שני קישורים: &quot;RunSession&quot; ו &quot;Incubatדואר &quot;. לחץ על&quot; &quot;אפשרות RunSession. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש, החלון assay, יופיעו עם זרימה באמצע. בחר את &quot;RunSession&quot; פריט (זה צריך להיות הפריט הנוכחי בלבד). בצד ימין של המסך התפריט הנפתח תופיע. מצא את שמו של רי ששמרת SkanIt להפעיל בתפריט זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבחרת פרוטוקול שלך, בפינה הימנית העליונה לחץ על &quot;הפעל assay&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת יצוץ, תתבקש לציין אשר מגזין להשתמש בו כמקור, ואשר מגזין ריקה. תיבת נמוך יותר על המסך המתאים מגזין הקדמי. [אופציונלי: הוא מבקש ממך להזין את מספר צלחות עמוסות לקבוע אומדן בסכום של זמן זה ייקח. אומדן זה הוא בדרך כלל רחוק.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו גם RapidStak ואת VarioSkan מופעלים, ולחץ על &quot;אישור&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RapidStak יטען אוטומטית צלחות שלך לתוך קורא את הצלחת, המאפשר מדידה רציפה של הצלחות. הערה: מומלץ לקיים את הטעינה הראשונה לתוך צלחת VarioSkan כדי להבטיח תיאום נאות של המכונות. אם RapidStak לא להעמיס על הקורא צלחת כראוי, להשתמש &quot;זה assay השהה&quot; כפתור בפינה הימנית העליונה של חלון PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VarioSkan נעשה לקרוא את כל הצלחות, להסיר את המגזין מלא ומניחים אותו על משטח הטעינה המגזין. הרימו את המלבן החיצוני של הפלטפורמה, ומגזין צריך להחליק משם, משאיר את הלוחות עומדים בערימה באמצע. הצלחות יכול להיות מסולק על פי נהלי המעבדה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצא את ספיגת קריאות, לפתוח תוכנה SkanIt רי, ולבחור &quot;פתח קובץ קיים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הספרייה בה שמרת ההפעלה שלך, פגע &quot;+&quot; סמל כדי להרחיב את הרשימה תחת הכותרת הכותרת יהיו אפשרויות שכותרתו &quot;מיכל 1&quot; ל &quot;מיכל N&quot; בהתאם למספר צלחות. בחר את הצלחת הראשונה להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת התפריטים בחלקו העליון של הדף, בחר &quot;עיבוד נתונים&gt; דווח / ייצוא&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרויות הרצויות לייצוא. הערה: אני בדרך כלל לבחור &quot;פריסה פלייט&quot; ו &quot;photometric&quot; הנתונים לייצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;הצג דוח&quot; ולאחר מכן &quot;File&gt; Save&quot;. בחר את הספרייה הרצויה. תבנית הפלט הוא גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה קריאות ספיגת מהצלחת 384 יחיד היטב המכיל שיבוט חיובי מוצג באיור 2. שיבוטים חיובית להראות עלייה ניכרת ספיגת פני אלה שלא להביע את פעילות cellulase. הבדלים זמן assay, מיקום טוב על הצלחת, או ריכוז DNP (ניתן הציג ידי סינון בלתי מומס DNP) יכולה להשפיע על ספיגת קריאות מוחלטת. קריאות ספיגת יחסית, כגון ההבדל ספיגת מעל הממוצע צלחת או ממוצע העמודה, הם שיטה חזקים יותר לזהות שיבוטים חיובי cellulase. בעקבות זיהוי של שיבוטים חיובי מהצלחות ספריה, מומלץ לשכפל כל שיבוטים חיובית לתוך צלחת חדשה לסינון משנית. זה מבטל תופעות הנובעות מיקום טוב או וריאציה צלחת ומאפשר השוואה ישירה בין שיבוטים יותר חיובי. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים זרימה של assay תפוקה גבוהה עבור ספריית metagenomic משובטים לתוך E. coli ומאוחסנים ב -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ספיגת קריאות מתוך צלחת אחת 384-clone המכיל גם חיובית. שיבוטים חיובי cellulase ניתן לזהות על ידי ספיגת גדל באופן משמעותי על שיבוטים שלילית.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מסך התפוקה גבוהה לגילוי המהיר של הפעילות cellulolytic מתוך ספרייה גדולה להכניס DNA הגנומי metagenomic לידי ביטוי E. coli מתואר בפרוטוקול זה. שיטה זו מהווה שיפור של assay האדום CMC / קונגו נפוץ בספרות. זהו פתרון המבוסס, ומאפשר הקרנה חד סיר הכימיה-384 גם צלחות, עם הפלט הסופי כמו קריאות ספיגת מקורא צלחת המאפשר ניתוח כמותי. האוטומציה של כל שלב של תהליך זה מאפשר הקרנת ללא השגחה של יותר מ -25 צלחות 384-היטב לשעה. הנתונים ניתן לייצא בקלות לתוך הגיליון האלקטרוני של Microsoft Excel מתוך התוכנה, המאפשר ניתוח או עיבוד על ידי תוכנות צד שלישי. מגבלה אחת של assay זה קיים פוטנציאל הביטוי של חלבונים אקסוגני של E. החיידק המארח. ספריה metagenomic מכיל דנ&quot;א אורגניזמים רבים ושונים, רק קבוצת משנה של מה שיכול להיות מוכר על ידי ה coli שעתוק / מכונות תרגום. גם כאשר הביע, מוצרי גן אקסוגניים לא יכול להשיג פונקציונליות עקב קיפול עיבוד פסולים, או רמות ביטוי לקוי. מגבלות אלה יכולים להיות קוזז חלקית על ידי ניצול של מערכות בקרה להעתיק, כפי שניתן לראות פונקציונלי במחקרים קודמים ההקרנה metagenomic. 12. השליטה pCC1 להעתיק fosmid משמש כאן מאפשר אינדוקציה באמצעות תוספת של inducer L-arabinose, ומגבירה מספר עותק מאחד, של עד 100 עותקים לכל תא 13. מערכות אלו יכולים לשפר את תוצאות הפעילות של מסכי מבוססי בכך שהיא מאפשרת צמיחה עותק יחיד על יציבות עם אינדוקציה הבאים לפעילות מוגברת. המצע 2,4-DNP-Cellobioside להשתמש במסך שלנו אינו זמין מסחרית מהספקים, אבל מצעים דומים ניתן לרכוש. סיגמא אולדריץ מציעה 2-nitrophenyl (חתול מס &#39;N4764) ו 4-nitrophenyl (חתול מס&#39; N5759) cellobiosides. המסך הרחב כפי שתואר יכול להתבצע עם מצעים אלה, אבל כמה שינויים יהיה צורך. פנולים אלה מונו מחליפים יש יותר ערכים PKA, סביב 7.2, בהשוואה ל DNP, אשר מסביב 4. PH אופטימלי לפעילות cellulase דווחה בטווח 4.5-6.0 pH 14, 15. השימוש DNP-C מאפשר assay להתבצע בתנאי pH אופטימלי, המאפשר זיהוי קל של cellulases. בנוסף, glycoside di-להחליף הרבה יותר תגובתי מהאחרים, המאפשר זיהוי של cellulases מסויגת יותר. לפיכך, השימוש DNP-cellobioside אפשרה עבור מסך חזקים יותר ורגישים יותר יהיה זמין עם מצעים מסחרי. ראוי לציין כי מסך זה יכול לשמש לאיתור של כל האנזימים עם המצע colorimetric או fluorometric קשור. Cellulases הם אנזים פעיל יציבה, האידיאלי לפיתוח אופטימיזציה ראשונית של הפרמטרים ההקרנה. הגישה הכללית המוצג כאן הוא כלי רב עוצמה עבור ההקרנה של ספריות metagenomic שני יישומים אקדמיים ותעשייתיים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

תאית, המקור הנפוץ ביותר של פחמן אורגני על פני כדור הארץ, יש טווח רחב יישומים תעשייתיים עם דגש הולך וגובר על ייצור דלק ביולוגי 1. שיטות כימיות לשנות או לבזות תאית בדרך כלל דורשים חומצות חזקות וטמפרטורות גבוהות. ככזה, שיטות אנזימטיות הפכו בולטים בתהליך bioconversion. בעוד זיהוי cellulases פעיל מן מבודד חיידקים ופטריות הייתה יעילה למדי, הרוב המכריע של חיידקים בטבע להתנגד טיפוח מעבדה. הגנומי הסביבה, הידוע גם גישות, הקרנת metagenomic יש הבטחה גדולה לגשר על הפער טיפוח בחיפוש אחר אנזימים bioconversion רומן. גישות ההקרנה Metagenomic התאוששו בהצלחה cellulases רומן מסביבות מגוונות כגון 2 קרקעות, תאו כרס פנימית 3 ו טרמיטים האחוריות בטן 4 משתמש (CMC) carboxymethylcellulose צלחות אגר מוכתם קונגו צבע אדום (מבוסס על שיטת Teather ועץ 5). עם זאת, השיטה CMC היא מוגבלת התפוקה, אינו מתבטא כמותית אות נמוך יחס רעש 6. שיטות אחרות דווחו 7,8 אבל כל אחד להשתמש בצלחת אגר מבוססי assay, אשר אינה רצויה להקרנה תפוקה גבוהה של ספריות גנטי גדול להוסיף. כאן אנו מציגים פתרון המבוסס על המסך לפעילות cellulase באמצעות dinitrophenol chromogenic (DNP)-cellobioside המצע 9. הספרייה שלנו משובטים לתוך השליטה pCC1 את העותק fosmid כדי להגביר את הרגישות assay באמצעות אינדוקציה עותק מספר 10. השיטה משתמשת בסיר אחד הכימיה-384 גם microplates עם readout הסופי כאמור מדידת ספיגת. Readout זה כמותי, רגיש אוטומטית עם תפוקה של עד 384-100x צלחות טוב ליום באמצעות המטפל נוזלי קורא צלחת עם מערכת לערום המצורפת.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries at JoVE.com

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Google

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  University of British Columbia - UBC. פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

Video: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;