המטרה הכוללת של שיטה זו היא לנתח את ההשפעה של טיפול בלחץ על תאים חיידקיים, הן בתא יחיד והן ברמת האוכלוסייה. הוא מספק חזון גלובלי של השפעת הלחץ על היבטים שונים של צמיחת חיידקים, כולל כדאיות התא, מורפולוגיה, ותותוכן DNA. זה גם מאפשר לאפיין את התאוששות האוכלוסייה.
שיטה זו יכולה לשמש בתעשיית התרופות כדי לסנן את הפעילות של מולקולה מיקרוביאלית חדשה ולהעריך את השפעתם על הכדאיות והצמיחה של חיידקים. לטיפול מעורר מתח יש חוסר יעילות, כגון מינון ותלוי בזמן. ייתכן שיהיה צורך לבצע בדיקות ראשוניות כדי לקבוע את המינון האופטימלי ואת משך הטיפול לפני תחילת פרוטוקול זה.
ההדגמה החזותית של שיטה זו מאפשרת לדמיין פרטים חשובים של כל שלב קריטי וכיצד לבצע אותם כראוי. כדי להתחיל, לחסן חמישה מיליליטר של MOPS EZ עשיר מוגדר בינוני עם מושבה אחת של E.Coli MG1655 HU-PAmCherry ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 140 סיבובים לדקה לילה. למחרת בבוקר, לחלץ 100 microliters של המדגם לדלל אותו עם 900 microliters של בינוני כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר.
לאחר מכן, לדלל את התרבות במבחנה המכילה מדיום טרי כדי OD600 ננומטר של 0.01. הדגירה את המבחנה מחוסן ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 140 סל"ד עד הצפיפות האופטית מגיע 0.2, המתאים לשלב מעריכי מלא במדיום עשיר. לאחר מכן, עלו על דגימות התרבות להדמיית מיקרוסקופיה של זמן לשגות, דילול וציפוי בדיקה, ניתוח ציטומטריית זרימה, ואת הדמיית תצלום מיקרוסקופיה.
חשוף את 4.4 המיליליטרים הנותרים של תאים במבחנה לטיפול מתח ספציפי. לדוגמה, 4.4 מיקרוליטרים של cephalexin בחמישה מיקרוגרם למיליליטר ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 140 סל"ד. הכינו דילול סדרתי פי עשרה, עד 10 עד מינוס שביעי, מתוך 200 המיקרוליטרים של דגימת התרבות במדיום טרי.
מערבבים בין כל דילול על ידי מערבולת עדינה מאוד או על ידי היפוך הצינור. צלחת 100 microliters של הדילול המתאים על צלחות אגרוז LB שלא נבחרו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, לספור את מספר המושבות כדי לקבוע את הריכוז של תאים קיימא בכל מדגם תרבות.
התווה את ה- CFU למיליליטר כפונקציה של זמן עבור תרבות התאים הלא מטופלות והמטופלות. למדוד את OD600 של התרבות על ספקטרופוטומטר. לדלל את מדגם התרבות עם בינוני טרי בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל מדגם עם OD600 ב 0.06, המתאים כ 15, 000 תאים למיקרוליטר.
עבור כתמי DNA, מערבבים את דגימת החיידקים המדוללים עם 10 מיקרוגרם למיליליטר פתרון של צבע פלואורסצנטי DNA בהקצבת נפח של אחד לאחד דגירה בחושך במשך 15 דקות. לפני הזרקת המדגם, מערבבים את המדגם על ידי מערבולת עדינה מאוד או על ידי היפוך הצינור. מעבירים את הדגימה לציטומטר הזרימה בקצב זרימה של כ-120,000 תאים בדקה.
רכוש אור מפוזר קדימה וצד מפוזר, כמו גם צבע פלואורסצנטי DNA / אות פלואורסצנטי עם ההגדרות המתאימות. התווה את היסטוגרמת צפיפות התאים המפוזרת קדימה כדי לייצג את התפלגות גודל התא ולתכנן את היסטוגרמת צפיפות התאים הפלואורסצנטיים/פלואורסצנטיים של הדנ"א כדי לייצג את תוכן ה- DNA באוכלוסיית התאים. ראשית, מחממים מראש את תא המיקרוסקופ התריס ב 37 מעלות צלזיוס כדי לייצב את הטמפרטורה.
הכינו את השקופיות המותקנות על אגואר כמתואר בכתב היד. מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ ובצע רכישת תמונה באמצעות אור משודר עם יעד ניגודיות פנים ועם גירוי מקור אור ב 560 ננומטר עבור mCherry. בחר שדות תצוגה המכילים תאים מבודדים כדי להקל על זיהוי תאים אוטומטי במהלך ניתוח תמונה.
ודא כי לפחות 300 תאים הם בתמונה כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי חזק של אוכלוסיית התא. ראשית, הסר את פתרון השימור מהצלחת המיקרופלואידית והחלף אותו במדיום טרי שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס כמתואר במדריך למשתמש בתוכנה מיקרופלואידית. חבר את הלוח המיקרופלואידי למערכת הסעפת.
ובתוכנה microfluidic, לחץ על כפתור חותם כדי לאטום על הצלחת למערכת סעפת. לאחר מכן, לחץ על כפתור Priming. מקם את הצלחת המיקרופלואידית עם מערכת סעפת על שלב המיקרוסקופ וחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, כדי למנוע דליעת התא microfluidic.
לאטום את הלוח microfluidic על המערכת microfluidic על ידי לחיצה על כפתור Seal Off. החלף את המדיום מ גם שמונה עם 150 microliters של מדגם תרבות ולהחליף את המדיום מגם אחד עד חמש עם המדיום הרצוי, עם או בלי reagent גרימת מתח. לאטום את הצלחת microfluidic ולה מניח אותו על שלב המיקרוסקופ.
בתוכנה microfluidic, להפעיל את הליך טעינת התא. בדוק כי טעינת התאים משביעת רצון על ידי התבוננות מתחת למיקרוסקופ באור משודר. התמקדו בקפידה במצב אור משודר ובחרו מספר תחומי תצוגה מראים חיידקים מבודדים שאינם צפופים, בסביבות 10 עד 20 תאים לכל 100 מיקרוליטרים רבועים.
בתוכנה microfluidic, לחץ על כפתור הפעל רצף מותאם אישית, ולאחר מכן לתכנת את הזריקה של המדיום גרימת מתח במהלך 10 דקות בשתי PSI, ואחריו הזרקה ב PSI אחד למשך הרצוי של טיפול הלחץ. בצע הדמיית מיקרוסקופיה במצב זמן לשגות עם מסגרת אחת כל 10 דקות, באמצעות ניגודיות פאזה באור משודר מקור אור 560 ננומטר בעירור עבור אות mCherry במידת הצורך. התחל את רכישת התמונה המיקרוסקופית ואת פרוטוקול ההזרקה המיקרופלואידית בו-זמנית.
פתח את תוכנת פיג'י ואת תוסף MicrobeJ. לניתוח תמונות, שחררו את כל התמונות המתאימות לשקופית מיקרוסקופ אחת לסגל הטעינה MicrobeJ כדי לשורר תמונות ולשמור את קובץ ערימות התמונות שהושג. לקבלת נתונים לשגות בזמן, פשוט שחרר את ערימת התמונה לתוך סרגל הטעינה של MicrobeJ.
הפעל את הזיהוי האוטומטי של קווי המתאר של התא בהתבסס על פילוח של תמונת ניגודיות פאזה ולהפעיל את זיהוי הגרעינים בהתבסס על פילוח של אות פלואורסצנטי DNA מוכתם. בדוק את הדיוק של זיהוי התא באופן חזותי ולהשתמש בכלי העריכה MicrobeJ לתיקון במידת הצורך. שמור את קובץ התוצאות שהושג.
לחץ על הסמל ResultJ כדי להשלים את הניתוח ולקבל את החלון ResultJ. נוצרים סוגים רבים ושונים של תרשימי פלט. התווה את ההיסטוגרמות המנורמלות של צורת התא או האורך ואת מספר הגרעין הממוצע לכל תא.
מחקר זה ניתח את ההתנהגות של תאי Escherichia coli K-12 במהלך חשיפה בלתי הולמת לקפלקסין, אנטיביוטיקה המעכבת באופן ספציפי את חלוקת התאים. תרבויות תאים גדל בנוכחות cephalexin הציגה עלייה דומה OD600 כמו תרבויות unstressed. הריכוז של תאים קיימא לא גדל כאשר cephalexin היה נוכח.
התאים החלו להתחלק שוב כאשר cephalexin הוסר ובסופו של דבר הגיע לריכוז שווה ערך לתרבות unstressed לאחר שעתיים. לחצים שונים גרמו לניתוק שונה של עקומות OD ו- CFU למיליליטר, בהתאם להשפעה המושרה. חשיפה לקפלקסין עוררה עלייה מקבילה בגודל התא ובתוכן הדנ"א.
כאשר cephalexin הוסר, גודל תא האוכלוסייה ותותוכן ה-DNA הצטמצם בהדרגה והפך דומה לאוכלוסייה unstressed לאחר שעתיים. Cephalexin עורר היווצרות של תאים ארוכים עם רוחב תאים נורמלי אז אין מחיצה septa. ניתוח תמונה כמותית אישר את גודל התא ואת עליית תוכן ה-DNA.
תמונות זמן לשגות לאשר כי התא התא התארך שכפול כרומוזום והפרדה לא עכבות על ידי חשיפה cephalexin. ניתוח של שושלת התאים filamented הראה כי חלוקת התא מחדש בערך 20 דקות לאחר שטיפת התרופה. חשוב לוודא שאוכלוסיית החיידקים נמצאת בצמיחה אקספוננציאלית מלאה לפני גרימת טיפולי מאמץ.
טיפול מעורר מתח המשמש בגישות אלה עלול להיות מסוכן עבור ניסיוני, כמו תרכובת גנוטוקסית. אז להתמודד עם תרכובת בזהירות ללבוש כפפה, מסכה, משקפי מגן, ומעיל מעבדה.
