Этот метод позволяет точно моделировать рецидивирующие лейкемогенные мутации усиления функции в первичных гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках человека и тем самым исследовать роль в лейкемической трансформации. Основным преимуществом этого метода является то, что мутационная инженерия на основе CRISPR-Cas9 сочетается с введением флуоресцентного репортера. Это позволяет однозначно идентифицировать, обогащать и отслеживать чистые гетерозиготно мутировавшие клеточные популяции.
Продемонстрировать процедуру будет Томмазо Сконоккья, научный сотрудник моей лаборатории. Для начала разработайте единую направляющую РНК с помощью онлайн-инструмента проектирования Benchling, выбрав опцию плюс создать. Затем нажмите на последовательность ДНК «с последующим импортом последовательностей ДНК» и импорт из баз данных».
Затем введите нужный ген и выберите «человека» в качестве вида. Нажмите на опцию поиска и выберите правильный импорт стенограммы. Выберите интересующую область, в которой будет введен разрыв двойной пряди.
Затем выберите опцию CRISPR в правой части экрана, а затем разработайте и проанализируйте направляющие. Затем выберите «один направляющий», сохранив длину направляющей до 20 пар оснований и последовательность PAM для редактирования с помощью SP-Cas9. Выберите гид с высоким целевым баллом и высоким нецелевым баллом и закажите одну направляющую РНК в качестве химически модифицированной синтетической однонаправленной РНК у коммерческого поставщика.
Чтобы разработать шаблон HDR, импортируйте геномную последовательность и кодирующую последовательность в программное обеспечение для молекулярного клонирования. Из файла геномной последовательности спроектируйте левый гомологический рычаг, выбрав, в идеале, 400 пар оснований на пяти простых концах разрывов двойной цепи и вставьте эту последовательность в новый файл. Из файла геномной последовательности спроектируйте акцепторную последовательность сращивания, выбрав последние 150 пар оснований целевого интрона и вставив его после левого гомологического рычага.
Из файла последовательности кодирования выберите интересующую кДНК. Кодон оптимизирует кДНК и вставляет ее после последовательности акцептора сращивания. После интересующей кДНК вставьте три простых сигнала полиаденилирования после промоторной последовательности для флуоресцентного белка.
Затем вставьте последовательность для флуоресцентного белка и второй, но другой сигнал полиаденилирования. Из файла геномной последовательности спроектируйте правильный гомологический рычаг, выбрав в идеале 400 пар оснований на трех простых концах разрывов двойной цепи, и вставьте последовательность после второго полиаденилирования. Затем создайте копию всего шаблона и измените интересующую кДНК так, чтобы она содержала последовательность нужной мутации.
Замените флуоресцентный белок другим флуоресцентным белком. Создайте и клонируйте шаблоны HDR в вектор выражения AAV. Для рекомбинантного приготовления AAV6 приготовьте 10 150-миллиметровых блюд, каждое из которых содержит 11 миллионов HECK293T в 20 миллилитрах DMEM, дополненных 10% FBS, 1% пенициллина стрептомицина и 25 миллимолярных HEPES.
Затем поместите посуду в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа, в течение 24 часов. После тщательного выброса старой среды замените ее 20 миллилитрами DMEM без антибиотиков, дополненные 10% FBS, 25 миллимолярными HEPES и одним миллимолярным бутиратом натрия. Далее подготовьте две 15-миллилитровые трубки с маркировкой пробирки одна и две.
К первой трубке добавляют пять миллилитров восстановленной сывороточной среды, 60 мкг рекомбинантной AAV6-мутированной плазмиды HDR и 220 мкг вспомогательной плазмиды PDGM6. К пробирке второй добавляют пять миллилитров восстановленной сывороточной среды и 1120 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр раствора полиэтиленамина. После добавления содержимого трубки два в трубку одну, вихрь в течение 30 секунд, а затем инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре.
Осторожно добавьте по каплям 1,1 миллилитра раствора в каждое блюдо и распределите аккуратно, закручивая. Поместите посуду в инкубатор при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, на 48 часов. Затем добавьте 250 микролитров 0,5 молярной ЭДТА к каждой посуде и поместите их в инкубатор на 10 минут.
Соберите клетки, смыв их с посуды и переместив в 500-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифуга при 2000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант. Ослабьте гранулу путем вихря и извлеките вирус с помощью комплекта очистки AAV.
После алицитирования очищенного вируса храните его при минус 80 градусах Цельсия. После оттаивания CD34 положительных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток переносят клетки в 10 миллилитров предварительно подогретого RPMI, дополненного 1% пенициллином стрептомицином. Центрифуга при 350 Г при комнатной температуре в течение 10 минут.
Суспендировать клетки в гемопоэтическом стволе и среде удержания клеток-предшественников до концентрации 250 000 клеток на миллилитр и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 72 часов. Затем соберите клетки в 15-миллилитровую трубку. Подсчитайте и проверьте жизнеспособность клеток с помощью исключения синего трипана.
Чтобы приготовить рибокуклеопротеиновый комплекс, добавьте 15 мкг Cas9 и восемь микрограммов одиночной направляющей РНК в 1,5 миллилитровую трубку и инкубируйте при 25 градусах Цельсия в течение 10 минут в нагревательном блоке. Пока рибонуклеопротеиновый комплекс инкубируется, центрифугируют клетки при 350 Г в течение пяти минут и выбрасывают супернатант. После приостановки клеток в 100 микролитрах раствора нуклеофекции смешайте клетки с рибонуклеопротеиновым комплексом и перенесите их в кювету.
После осторожного постукивания по кювете, чтобы удалить любые остаточные пузырьки воздуха, вставьте кювету в держатель системы трансфекции и электропорируйте ячейки. Сразу после электропорации добавляют 400 микролитров предварительно подогретого гемопоэтического ствола и среды удержания клеток-предшественников без пенициллина стрептомицина и переносят клетки тонкой переносной пипеткой в культуральную пластину, содержащую предварительно подогретый гемопоэтический ствол и среду удержания клеток-предшественников без пенициллина стрептомицина. Затем переложите тарелку в инкубатор.
Разморозьте флаконы, содержащие замороженные рекомбинантные AAV на льду, и переведите клетки, пипетируя оптимальное количество каждого рекомбинантного AAV6 в клеточную суспензию. После осторожного смешивания клеточной суспензии с пипеткой, инкубируйте трансдуцированные клетки в течение шести-восьми часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через шесть-восемь часов соберите клетки в трубку и центрифугируйте их при 350 г при комнатной температуре в течение пяти минут.
Выбросьте супернатант и замените его свежей предварительно подогретой гемопоэтической стержневой и прогениторной средой удержания клеток, дополненной пенициллиновым стрептомицином, и перенесите клетки на пластину клеточной культуры. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Чтобы проточно сортировать инженерные клетки, несущие гетерозиготную мутацию усиления функции, соберите клетки в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 350 Г при комнатной температуре в течение пяти минут, как было продемонстрировано ранее.
Удалить супернатант и приостановить ячейки в одном миллилитре DPBS, содержащем 0,1% ПСА, и снова центрифугу при 350 г при комнатной температуре в течение пяти минут. После выброса супернатанта суспендируйте клетки в соответствующем объеме DPBS плюс 0,1% BSA в зависимости от количества клеток, как показано ранее. Перенесите ячейки в стерильную факсимильную трубку, оснащенную колпачком, и добавьте семь AAD или другого красителя жизнеспособности в суспензию ячейки для исключения живых/мертвых клеток.
Отсортируйте живые клетки, которые являются двойными положительными для флуоресцентных репортерных белков, в коллекторную трубку, содержащую 200 микролитров гемопоэтического ствола и среды удержания клеток-предшественников. После центрифугирования отсортированных клеток при 350 г при комнатной температуре в течение пяти минут, как было продемонстрировано ранее, до концентрации 250 000 клеток на миллилитр для дальнейшего расширения в культуре или используют клетки непосредственно для функциональных анализов. Через два дня после трансвекции рибонуклеопротеиновым комплексом и трансдукции рекомбинантными вирусами AAV6 клетки анализировали методом проточной цитометрии.
Были обнаружены четыре основные популяции, в том числе клетки без редактирования генома на основе HDR, экспрессирующие ни GFP, ни BFP-клетки, положительные только для GFP с интегрированной конструкцией дикого типа, клетки положительные только для BFP с интегрированной только мутированной конструкцией, а GFP и BFP двойные положительные клетки с интегрированными как диким типом, так и мутированными последовательностями. Для подтверждения успешного выбивания гетерозиготных мутаций калретикулина в/из ПЦР проводили на геномной ДНК, извлеченной из клеток, инкубированных только с AAV, и из клеток, инкубированных с рибонуклеопротеином и AAV с выбитым калретикулином дикого типа и последовательностью делеции калретикулина. Клетки были отсортированы на основе одновременной экспрессии обоих флуоресцентных репортеров до экстракции ДНК.
После гелевого электрофореза отдельные полосы были вырезаны из геля, а ДНК была извлечена для последующего секвенирования Сэнгера. Результаты секвенирования подтвердили успешную бесшовную интеграцию дикого типа и мутировавших последовательностей в гетерозиготных калретикулин-мутированных гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках. Самое главное, что нужно помнить при попытке этой процедуры, это тщательно выбирать наиболее эффективную одиночную направляющую РНК, так как это определит общую эффективность HDR и, следовательно, частоту успешного выбивания гетерозиготных мутаций.
После этой процедуры генетически модифицированные клетки могут быть использованы для функциональных экспериментов in vitro и in vivo, таких как колониеобразующие единичные анализы, дифференцировальные анализы и трансплантация мышам с иммунодефицитом.
