Diese Methode ermöglicht die präzise Modellierung rezidivierender leukämogener Gain-of-Function-Mutationen in primären humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen und damit die Untersuchung der Rolle bei der leukämischen Transformation. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das CRISPR-Cas9-basierte Mutations-Engineering mit der Einführung eines Fluoreszenzreporters kombiniert wird. Dies ermöglicht die einzigartige Identifizierung, Anreicherung und Verfolgung von reinen heterozygot mutierten Zellpopulationen.
Tommaso Sconocchia, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Entwerfen Sie zunächst die Einzelleit-RNA mit dem Online-Design-Tool von Benchling, indem Sie die Option zum Erstellen mit Plus auswählen. Klicken Sie dann auf DNA-Sequenz "gefolgt von DNA-Sequenzen importieren" und Option "Aus Datenbanken importieren".
Geben Sie dann das gewünschte Gen ein und wählen Sie "Mensch" als Spezies aus. Klicken Sie auf die Option "Suchen" und wählen Sie den richtigen Transkriptimport aus. Wählen Sie den gewünschten Bereich aus, in dem der Doppelstrangbruch eingeführt werden soll.
Wählen Sie dann die Option "CRISPR" auf der rechten Seite des Bildschirms, gefolgt von Design- und Analyseanleitungen. Wählen Sie als nächstes "Einzelne Führung" aus, während Sie die Führungslänge auf 20 Basenpaare und die PAM-Sequenz für die Bearbeitung mit SP-Cas9 beschränken. Wählen Sie einen Guide mit einem hohen On-Target-Score und einem hohen Off-Target-Score und bestellen Sie die Single-Guide-RNA als chemisch modifizierte synthetische Single-Guide-RNA bei einem kommerziellen Anbieter.
Um die HDR-Vorlage zu entwerfen, importieren Sie die genomische Sequenz und die kodierende Sequenz in die Software für das molekulare Klonen. Entwerfen Sie aus der genomischen Sequenzdatei den linken Homologiearm, indem Sie idealerweise 400 Basenpaare am fünf Primzahlende der Doppelstrangbrüche auswählen und diese Sequenz in eine neue Datei einfügen. Entwerfen Sie aus der genomischen Sequenzdatei die Spleißakzeptorsequenz, indem Sie die letzten 150 Basenpaare des Zielintrons auswählen und nach dem linken Homologiearm einfügen.
Wählen Sie aus der Kodierungssequenzdatei die gewünschte cDNA aus. Codon optimiert die cDNA und fügt sie nach der Spleißakzeptorsequenz ein. Fügen Sie nach der interessierenden cDNA ein dreistufiges Polyadenylierungssignal ein, das einer Promotorsequenz für das fluoreszierende Protein folgt.
Dann fügen Sie die Sequenz für das fluoreszierende Protein und ein zweites, aber anderes Polyadenylierungssignal ein. Entwerfen Sie aus der genomischen Sequenzdatei den rechten Homologiearm, indem Sie idealerweise 400 Basenpaare an den drei Hauptenden der Doppelstrangbrüche auswählen und die Sequenz nach der zweiten Polyadenylierung einfügen. Erstellen Sie dann eine Kopie der gesamten Vorlage und modifizieren Sie die gewünschte cDNA so, dass sie die Sequenz der gewünschten Mutation enthält.
Tauschen Sie das fluoreszierende Protein gegen ein anderes fluoreszierendes Protein aus. Erstellen und klonen Sie die HDR-Vorlagen in den AAV-Ausdrucksvektor. Für die rekombinante AAV6-Zubereitung bereiten Sie 10 150-Millimeter-Schalen vor, die jeweils 11 Millionen HECK293T in 20 Millilitern DMEM enthalten, die mit 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 25 Millimolar-HEPES ergänzt sind.
Dann stellen Sie das Geschirr 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, in den Inkubator. Nachdem Sie das alte Medium vorsichtig entsorgt haben, ersetzen Sie es durch 20 Milliliter antibiotikafreies DMEM, das mit 10% FBS, 25 Millimolar HEPES und einem Millimolar Natriumbutyrat ergänzt wird. Als nächstes bereiten Sie zwei 15-Milliliter-Röhrchen vor, die mit den Röhrchen eins und zwei beschriftet sind.
Zu Röhrchen eins fügen Sie fünf Milliliter reduziertes Serummedium, 60 Mikrogramm rekombinantes AAV6-mutiertes HDR-Plasmid und 220 Mikrogramm PDGM6-Helferplasmid hinzu. In Röhrchen zwei fünf Milliliter reduziertes Serummedium und 1120 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Polyethylenaminlösung geben. Nach Zugabe des Inhalts von Röhrchen zwei zu Röhrchen eins 30 Sekunden lang wirbeln und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Geben Sie vorsichtig tropfenweise 1,1 Milliliter der Lösung in jede Schale und verteilen Sie sie durch sanftes Schwenken. Stellen Sie das Geschirr 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, in den Inkubator. Dann fügen Sie 250 Mikroliter 0,5 molare EDTA zu jeder Schale hinzu und legen Sie sie für 10 Minuten in den Inkubator.
Ernten Sie die Zellen, indem Sie sie von der Schale abwaschen und in ein 500-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Bei 2000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Lösen Sie das Pellet durch Wirbeln und extrahieren Sie das Virus mit einem AAV-Reinigungskit.
Nachdem Sie das gereinigte Virus aliquotiert haben, lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius. Nach dem Auftauen von CD34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen werden die Zellen in 10 Milliliter vorgewärmtes RPMI übertragen, das mit 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Zentrifuge bei 350 g bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Suspendieren Sie die Zellen in hämatopoetischem Stamm- und Vorläuferzellretentionsmedium auf eine Konzentration von 250.000 Zellen pro Milliliter und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 72 Stunden. Als nächstes ernten Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Zählen und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss.
Zur Herstellung des Ribocucleoprotein-Komplexes werden 15 Mikrogramm Cas9 und acht Mikrogramm Einzelleit-RNA in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben und bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten in einem Heizblock inkubiert. Während der Ribonukleoproteinkomplex inkubiert, zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 G für fünf Minuten und verwerfen Sie den Überstand. Nachdem Sie die Zellen in 100 Mikroliter Nukleofektionslösung suspendiert haben, mischen Sie die Zellen mit dem Ribonukleoproteinkomplex und übertragen Sie sie in die Küvette.
Nachdem Sie vorsichtig auf die Küvette geklopft haben, um verbleibende Luftblasen zu entfernen, führen Sie die Küvette in die Halterung des Transfektionssystems ein und elektroporieren Sie die Zellen. Unmittelbar nach der Elektroporation werden 400 Mikroliter vorgewärmter hämatopoetischer Stamm und Vorläuferzellretentionsmedium ohne Penicillin-Streptomycin hinzugefügt und die Zellen mit einer feinen Transferpipette in eine Kulturplatte übertragen, die vorgewärmten hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzellretentionsmedium ohne Penicillin-Streptomycin enthält. Übergeben Sie dann die Platte in den Inkubator.
Tauen Sie die Fläschchen mit den gefrorenen rekombinanten AAVs auf Eis auf und transduzieren Sie die Zellen, indem Sie die optimale Menge jedes rekombinanten AAV6 in die Zellsuspension pipettieren. Nach dem vorsichtigen Mischen der Zellsuspension mit der Pipette inkubieren Sie die transduzierten Zellen für sechs bis acht Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nach sechs bis acht Stunden sammeln Sie die Zellen in einem Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 350 g Raumtemperatur für fünf Minuten.
Verwerfen Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn durch frischen, vorgewärmten hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzellretentionsmedium, ergänzt mit Penicillin-Streptomycin, und übertragen Sie die Zellen auf eine Zellkulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um die künstlich hergestellten Zellen, die die heterozygote Gain-of-Function-Mutation tragen, zu sortieren, ernten Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 350 G bei Raumtemperatur für fünf Minuten, wie zuvor gezeigt.
Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter DPBS mit 0,1 % PSA und zentrifugieren Sie erneut bei 350 g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach dem Verwerfen des Überstands suspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen von DPBS plus 0,1 % BSA, abhängig von der Zellzahl, wie zuvor gezeigt. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Faxröhrchen, das mit einer Kappe ausgestattet ist, und fügen Sie der Zellsuspension sieben AAD- oder andere Lebensfähigkeitsfarbstoffe hinzu, um lebende/tote Zellen auszuschließen.
Sortieren Sie die lebenden Zellen, die doppelt positiv für die fluoreszierenden Reporterproteine sind, in ein Sammelröhrchen mit 200 Mikrolitern hämatopoetischem Stamm- und Vorläuferzellretentionsmedium. Nach dem Zentrifugieren der sortierten Zellen bei 350 G bei Raumtemperatur für fünf Minuten, wie zuvor gezeigt, auf eine Konzentration von 250.000 Zellen pro Milliliter für die weitere Expansion in Kultur oder verwenden Sie die Zellen direkt für funktionelle Assays. Zwei Tage nach der Transvektion mit dem Ribonukleoprotein-Komplex und der Transduktion mit den rekombinanten AAV6-Viren wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Es wurden vier Hauptpopulationen entdeckt, darunter Zellen ohne HDR-basierte Genom-Editierung, die weder die GFP- noch die BFP-Zellen exprimierten, die nur für GFP positiv waren, wobei nur das Wildtyp-Konstrukt integriert war, Zellen, die nur für BFP positiv waren, wobei nur das mutierte Konstrukt integriert war, und GFP- und BFP- doppelt positive Zellen, bei denen sowohl der Wildtyp als auch mutierte Sequenzen integriert waren. Um den erfolgreichen Knock-in der heterozygoten Calretikulin-Mutationen zu validieren, wurde eine in/out-PCR an genomischer DNA durchgeführt, die aus Zellen extrahiert wurde, die nur mit AAV inkubiert wurden, und aus Zellen, die mit dem Ribonukleoprotein und AAV mit dem Knocked-in-Calreticulin-Wildtyp und der Calreticulin-Deletionssequenz inkubiert wurden. Die Zellen wurden basierend auf der gleichzeitigen Expression beider Fluoreszenzreporter vor der DNA-Extraktion sortiert.
Nach der Gelelektrophorese wurden einzelne Banden aus dem Gel herausgeschnitten und DNA für die anschließende Sanger-Sequenzierung extrahiert. Die Sequenzierungsergebnisse bestätigten die erfolgreiche nahtlose Integration der Wildtyp- und mutierten Sequenzen in die heterozygoten-Calretikulin-mutierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. Das Wichtigste, woran man sich bei diesem Verfahren erinnern sollte, ist die sorgfältige Auswahl der leistungsfähigsten Single-Guide-RNA, da dies die Gesamt-HDR-Effizienz und damit die Häufigkeit des erfolgreichen Knock-in von heterozygoten Mutationen bestimmt.
Nach diesem Verfahren können die gentechnisch veränderten Zellen für funktionelle In-vitro- und In-vivo-Experimente wie koloniebildende Einheiten-Assays, Differenzierungs-Assays und Transplantation in immundefiziente Mäuse verwendet werden.
