The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O&#8217;Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

הערה: פרוטוקול זה דורש שימוש בדגימות דם היקפיים ממתנדבים אנושיים. כל המחקר עם בני אדם צריך להיבדק ואושר על ידי דירקטוריון סקירה מוסדית אדם מחקרים כדי להבטיח עמידה בהצהרת הלסינקי (2013) וביטוח בריאות טלטלות הדין והחשבון Act משנת 1996. 1. בידוד של תאי T מדם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, לחמם את מדיום שיפוע הצפיפות לטמפרטורת חדר. Aliquot 4 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתוך צינורות צנטריפוגה חרוטי 2-4 15 מיליליטר סטרילי (צינור 1 ישמש לכל 10 מיליליטר נפח כולל של דם מדולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 10-20 מיליליטר של דם בתרסיס הפרין 1-2 נתרן מצופה (ירוקה עליונה) צינורות איסוף דם ורידים. לאסוף דגימות אנושיות תחת הפיקוח של אנשים מאומנים ובהתאם למועצה לביקורת מוסדית פרוטוקול שאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את החלק החיצוני של הצינורות עם 70% אתנול. מוציא בזהירות את החלק העליון של fiמלא צינורות איסוף ולמזוג את הדם לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר תמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS) על צינור אחד איסוף דם. לאסוף את PBS, להוסיף לכל הדם יצק, ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl קוקטייל / 2 מיליליטר העשרת תא T האנושי נפח כולל. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מיליליטר, שכבה של עד 10 מיליליטר של 1: הדם המדולל 1 בעדינות על גבי מדיום שיפוע צפיפות. להיות זהיר כדי לא לשבש את פני השטח של מדיום שיפוע צפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דם צנטריפוגה שכבתי ובינוני שיפוע צפיפות של 1,200 XG במשך 20 דקות ב -20 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות בצנטריפוגה, נזהר שלא לשבש את הממשק בין מדיום שיפוע צפיפות והשכבה של לויקוציטים בממשק שבין מדיום שיפוע צפיפות והפלזמה בדילול מלא. בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, לאסוף בזהירות את השכבה לויקוציטים ולהעביר לאמבטית סטרילי חדשה 50 מיליליטר חרוטידואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף PBS להביא את הנפח של PBL נאסף 50 מ&quot;ל ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend pelleted תאים בזרימת סטרילי 10 מיליליטר cytometry מיון חיץ (PBS-מסונן סטרילי המכיל 1% BSA). לדוגמא 10 μl של השעיה תא, לדלל 01:10 (להוסיף 90 μl) trypan כחול לספור תאים באמצעות hemocytometer (תשואה צפויה 1 - 4 x 10 6 תאים / צינור של דם מלא). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר aliquot 1 מיליליטר, להעביר עד 5 צינור מיליליטר, ולשמור על קרח לניתוח של תאי T לא מסומנים על ידי tetramer. שמור השעיה תא על קרח. </li></ol></li></ol> 2. העשרה מגנטית של תאי T Alloantigen הספציפיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל tetramer pMHC alloantigen עד 1: 100 במאגר מסוג סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה (9 מיליליטר מצעד 1.11) ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של דילול alloantigen tetramer pMHC לpelletedתאים (עד 10 7 תאים). מערבבים על ידי pipetting העדין. מעביר צינור 5 מיליליטר סטרילי. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר סוג חיץ. צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולים ב100 חיץ סוג μl. הוסף 10 μl קוקטייל יוטין בחירה ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl חלקיקים מגנטיים ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיליליטר סוג החיץ ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. הסר 100 aliquot μl, להעביר עד 5 צינור מיליליטר, ולשמור על קרח לניתוח של תאים טרום-העשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 5 מיליליטר מכיל את ההשעיה התא במגנט הפרדת תאים. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את הכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט ביחד, למזוג את תוכן הצינור לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור ללהסיר את הטיפות האחרונות של נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מהמגנט. הוסף 2 מיליליטר חיץ סוג קר ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. לדוגמא 10 μl של השעיה תא, לדלל 1: 2 (להוסיף עד 10 μl) trypan כחול לספור תאים באמצעות hemocytometer. </li></ol> 3. הכנת תאי T לתא בודד מיון תא cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ סוג קר לכל הצינורות של תאים (tetramer ללא תווית, מועשר האו&quot;ם, ומועשר שכותרתו tetramer שכותרתו tetramer) כדי להביא את נפח 3 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות ב 4 o C וחיץ למזוג להתאושש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי pelleted ב -25 חיץ סוג קר μl. הוסף 5 μl בלוק Fc אנושי. לדגור על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נוגדנים למיון cytometry הזרימה. מערבבים 15 חיץ μl סוג, 15 μl אנטי-CD5, 15 μl אנטי CD14, ו -15 μl אנטי-CD19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של תערובת נוגדנים על צינור אחד של תאים. לדגור על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של חיץ סוג קר על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות ב 4 o C וחיץ למזוג להתאושש תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בריכוז של x 1 -2 10 6 תאים / מיליליטר במאגר כזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של מדיום תרבות תא האנושי T Aliquot 100 μl (DMEM של Iscove בתוספת 2 מ&quot;מ Glutamax, 10 HEPES מ&quot;מ, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 10% סרום AB אנושי חום מומת, ואדם 2.5 ng / ml רקומביננטי IL-2) היטב בכל צלחת תרבות 96 גם עגולה תא תחתון. שמור על קרח. </li></ol> 4. בידוד של תאי T שכותרתו tetramer ידי תא בודד cytometry זרימת מיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים cytometry זרימת הפרמטרים gating כדי לזהות תאי tetramer alloantigen-pMHC שכותרתו T (איור 2 א). השתמש בחלק tetramer מראש ההעשרה שכותרתו להקים gating אסטרטגיות לחסל כפילויות, שער על הלימפוציטים, להוציא CD19 להביע תאי B וCD14להביע מונוציטים, ולזהות תאי T על ידי ביטוי CD5. השתמש במדגם לא שכותרתו עם tetramer כקרינת מינוס שליטה מי שיקים את gating לזיהוי תאי T מחייב tetramer (עם 0% מCD5 + CD14 - CD19 - תאים מהמדגם לא מסומן על ידי tetramer צריכים ליפול בתוך השער הזה) . הערה: gating אסטרטגיות שאינן הולם מחמירים יגרום בידוד של תאים שאינם-T או תאי T שאינם אנטיגן ספציפי, ואילו אסטרטגיות gating מדי מגבילות תפחית את מספר תאי T המבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת את הפרמטרים צלחת לסוג התא הבודד. כוון את סדרן למקום 1 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer + תא בכל טוב. כוון את הצלחת להגדיר להכיל בקרה 1 שלילית גם (לא תאים ממוינים לתוך הבאר) ו -1 ביקורת חיובית גם (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - תאים) בכל שורה (איור 2.ב </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזרימה הוקמה cytometry אסטרטגית gating והתקנת צלחת, בודד תאי T מחייב tetramer בודדים ישירות לתוך הצלחת 96-היטב באמצעות סדרן תא cytometric זרימה. </li></ol> 5. תרבות והרחבת שיבוטים תא T Alloantigen ספציפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת מיון תא, צלחת צנטריפוגות ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלסיוס צלחת מקום התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 גירוי מערבולת למשך 30 שניות כדי resuspend חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב נפח של חרוזים activator הנדרשים לגירוי של תאי T שנאספו (0.5 μl של microbeads activator / טוב). העבר את הנפח מחושב של חרוזים ממריץ לצינור 5 מיליליטר סטרילי. הוסף 1 מיליליטר בינוני אנושי תא T תרבות ומערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור עם תליוני microbead במגנט. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינותהכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט יחד, תוכן צינור למזוג לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מהמגנט. הוסף בינוני תרבית תאים אנושית T (100 בינוני μl / 0.5 μl של microbeads בתחילה הוסיף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot של השעיה חרוז activator 100 μl היטב בכל הצלחת 96-היטב. דגירה צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה מיקרוסקופית. אשכולות קטנים של תאים מתרבים אפשר לראות במיקרוסקופ לאחר 5 - 7 ימים של התרבות (איור 3.A). הערה: ויזואליזציה של תרביות תאי T בשלב זה יכול להיות קשה, והעדרו של צבירי תאים נצפים בשלב זה לא יכול להיות אינדיקציה לחוסר בתא T גדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 14 ימים לאחר בידוד תא, תרבויות הזנה על ידי הסרת זהירות של תקשורת 100 μl הנחה של חלקו העליון של התרבות ולהחליף עם 100 μ; בינוני טרי l T האנושי תרבית תאים. המשך דוגרים צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תא צמיחה מדי יום על ידי בדיקה והערכה של הצבע של מדיום התרבות מיקרוסקופית. צבירי תאים גדולים צריכים להיות גלויים מיקרוסקופי 2 - 3 ימים לאחר השינוי הבינוני. Macroscopically, כדורי תא צריכים להיות גלויים במהלך 14 הימים שלאחר השינוי הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיל 28 ימים שלאחר בידוד תא, לזהות שיבוטים גדלו בבדיקה מיקרוסקופית. העבר את 200 μl הנפח של תרבויות צלחת 96-היטב צמיחה חיובית לבארות בודדות של צלחת תרבית רקמת 48-היטב המכילה 200 מדיום תרבות תא μl אנושי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl מכיל 12.5 μl של microbeads אנטי CD3 / אנטי CD28 גירוי (שהוכן כמפורט בסעיפים 5.2-5.6). דגירה צלחת התרבות ב 37 o C ב-6% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על צמיחת התרבות יומית על ידי לשעבר מיקרוסקופיamination והערכה של הצבע של מדיום התרבות. כאשר תרבית תאי T מגיעה&gt; 2x10 מיליליטר 6 / (בדרך כלל 3-5 ימים לאחר מחדש גירוי, יכול להיות מוערך על ידי ביום שהתקשורת מתחילה להפוך קש צהוב), תרבות העברה גם צלחת תרבות 24 גם רקמה ולהוסיף 500 מדיום סלולארי μl אנושי T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב10-14 ימי מעקב מחדש גירוי, לאסוף 200 μl של תרבית תאי T להעריך alloantigen ספציפי על ידי cytometry זרימת ניתוח tetramer pMHC מחייב (באמצעות אסטרטגית התיוג וgating המתוארת בסעיפי 3 ו 4.1). </li></ol> 6. לטווח ארוך מחדש גירוי והתרבות של שיבוטים תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא הרף מחדש לעורר ולהרחיב תרביות תאי T משובטים עם סגוליות הרצויות יכול להיות בכל 14 ימים. לאסוף תרביות תאי T לתוך צינור 5 מיליליטר סטרילי ביום 14 הבא גירוי microbead אנטי CD3 / CD28 האחרון. לשלב בארות מרובות של אותו שיבוט תאי T בצינור אחד, עד נפח של 2.5 מיליליטר. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני להביא את הנפח הסופי של 2.5 מ&quot;ל ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור 5 מיליליטר מכיל תרבית תאי T לתוך מגנט הפרדת תא כדי להסיר microbeads הישן מהתרבות. הכובע צריך להיות באופן רופף על גבי הצינור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להסיר את הכובע מהצינור. מחזיק צינור ומגנט ביחד, למזוג את ההשעיה התא לתוך צינור 5 מיליליטר טרי. אין להקיש או ללחוץ את תוכן הצינור כדי להסיר את הטיפות האחרונות של נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני להביא את הנפח הסופי 4 מיליליטר. לדוגמא 10 μl לספור תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר תאי T על ידי צנטריפוגה ב 600 XG למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant למזוג. תאי Resuspend T ב 10 6 תאים / בינוני תרבית תאי T האנושי מיליליטר. העברת 1 מיליליטר aliquots היטב בכל צלחת תרבית רקמת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לעורר תאי T על ידי הוספת 100 מדיה μl מכילה 12.5 μl של אנטי CD3 / גירויmicrobeads NTI-CD28 (כמפורט בסעיפים 5.2-5.6). לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב-6% CO 2 באינקובטור. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation.">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li><li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens.">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li><li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+estimation+of+the+human+&#945;&#946;+T+cell+receptor+diversity.">A direct estimation of the human &#945;&#946; T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li><li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+&#946;-chain+diversity+in+&#945;&#946;+T+cells.">Comprehensive assessment of T-cell receptor &#946;-chain diversity in &#945;&#946; T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li><li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo:+new+answers+to+an+old+question.">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li><li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+T-cell+alloreactivity.">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li><li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire.">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li><li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+APCs,+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket.">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li><li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines.">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4++T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li><li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles.">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li><li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection,+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires.">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li><li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease.">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li><li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli.">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li><li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4++T+cell+responses.">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This ...

לימפוציטים מסוג T הם רכיבים קריטיים של המערכת החיסונית אדפטיבית. תאי T אחראים ללא רק ישירות תיווך תגובות חיסוניים הגנתיות לפתוגנים באמצעות מגוון רחב של מנגנוני מפעיל, אלא גם באופן פעיל שמירה על סובלנות עצמית חיסונית ומכוון את התגובות של תאים אחרים במערכת החיסונית. פונקציות אלה מופנות דרך מספר האותות משולבים, כולל קולטן תא T קשירה (TCR), ציטוקינים וכמוקינים, ומטבוליטים 1. האותות הללו, TCR הוא בעלת חשיבות מיוחדת, כפי שהוא מספק את הספציפיות האופייניות שמגדירה את התפקיד של תאי T בחסינות אדפטיבית. TCR אינטראקציה עם אנטיגנים פפטיד ליניארי שהוצגו על ידי MHC (HLA ortholog אדם) מולקולות (מתחמי pMHC) באופן ספציפי ורגיש מאוד לתת את האותות שליזום פונקצית מפעיל של תאי T. הפרמטרים ביוכימיים של אינטראקציות TCR עם הליגנדים pMHC לספק לא רק את הספציפיות לTהפעלת תא, אלא גם יש לו השפעה איכותית על תפקוד תאי T שלאחר מכן 2. כך, תפקוד התא T לומד לעתים קרובות דורש שבוחן את התגובות של תאי T המשובט עם סגוליות אנטיגני מוגדרות. התא האנושי T התא, המכיל כ 10 12 תאי T αβ, מכיל 10 7 מוערך - 10 8 αβTCRs שונה 3-4. רפרטואר מגוון זה מספק הזדמנות להכרה במגוון הרחב של פפטידים מפתוגנים פוטנציאליים שיחייב תגובה של תאי T לחסינות. ההערכה היא כי התדירות של תאי T מגיבה לאנטיגן הזר נתון שהוצג על ידי עצמי MHC היא בסדר הגודל של 10 -4 - 10 -7 בהעדר תגובה חיסונית לפני אנטיגן כי 5. הרפרטואר של תאי T הנאיבי מעוצב על ידי בחירת הרתי כדי להבטיח את היכולת לזהות עצמי MHC הצגת אנטיגנים פפטיד ומגבלה להגיבivity נגד אנטיגנים עצמי פפטיד, למקסם את התועלת הפוטנציאלית לתיווכם חסינות 2. עם זאת, בניגוד לזו שנועד תגובתיות, תדירות גבוהה יחסית, 10 -3 - 10 -4, תאי T מאנשים מערכת חיסון נאיביים להגיב לגירוי עם תאים אלוגנאית, הכרת שתי מולקולות MHC הזרות, כמו גם פפטידים אנדוגני שהם מציגים 6. ההכרה של הליגנדים pMHC אלוגנאית דומה מבנית להכרה של אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי עצמי MHC; TCR עושה אינטראקציות ביוכימיים קריטיות עם שתי מולקולת MHC אלוגנאית, כמו גם את הפפטיד מוצג 7. הטבע חזק של התגובה של תאי T לתוצאות גירוי אלוגנאית מהמגוון של pMHC קומפלקסים קיימים על פני השטח של תאים אלוגנאית 8. הערכה היא כי כל MHC מציג כ 2 x 10 4 אנטיגנים פפטיד אנדוגני שונים 9. ב זהreadth של תגובה לגירוי אלוגנאית הוא היבט משמעותי של פתולוגיה הקלינית הרלוונטית, כגון דחיית שתל או שתל לעומת המחלה מארח (GVHD), כתוצאה מalloreactivity תא T. מחקר של תגובות תא אנושיות T alloreactive הסתמך באופן מסורתי על בחינת תגובות polyclonal של תאי T נאיביים בעקבות גירוי עם תאים אלוגנאית. גירוי חוזר ונשנה עם אותו קו התא אלוגנאית בשילוב עם הגבלת דילול מנתח הוא מסוגל לייצר תאי T משובטים עם הכרה מוגדרת של אלוגנאית HLA 10. עם זאת, גישה זו היא בעייתית לבחינת תגובות לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד, כרפרטואר הרחב והמגוון של pMHC אנדוגני קומפלקסים נוכחי לאלוגנאית נתון HLA מגרה רפרטואר רחב של תאי T. גירוי האוכלוסייה בתפוצה רחבה וגישת דילול מגבילה ידרשו הקרנה של מספר הגדול של שיבוטים לבודד תאי T עם Reacti הרצויvity נגד יגנד pMHC יחיד. בנוסף, התדירות של תאי T מגיבים ליגנד pMHC אלוגנאית בודד היא נמוכה יחסית בקרב אוכלוסיות נאיביות תא T, המציגה מחסום לדור יעיל של שיבוטים תא T אנושיים מגיבים לאנטיגן נתון. זיהוי ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי מאוכלוסיות polyclonal שהופעלו על ידי הפיתוח של multimers pMHC fluorophore שכותרתו 11. גישה זו משתמשת אנטיגנים פפטיד ספציפיים נטענים לתוך מולקולות מסיסה רקומביננטי biotinylated MHC, שמסומנים על ידי ההיקשרות לfluorophore שכותרתו streptavidin. Multimerization של pMHC מגביר את הלהיטות, מפצה על זיקת מיסוד נמוך (מיקרומטר) של TCR להליגנדים pMHC מסיסים. ניתן לזהות תאים שכותרתו ומבודדים על ידי cytometry זרימה. עם זאת, גישה זו עדיין מוגבלת על ידי התדירות הנמוכה של תאי אנטיגן הספציפי T בין אוכלוסיות תאי T נאיביות, אשר בדרך כללסדרי הגודל פחות מהמגבלה של זיהוי וכימות מדויקים ברוב הזרימה cytometers. כדי לתת מענה למגבלה זו, שיטת תיוג pMHC tetramer והעשרת חרוז מגנטית שלאחר מכן לתאים שכותרתו tetramer פותחה 12. שיטה זו הוכיחה זיהוי אמין, ספירה, ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי בתדירות נמוכה. פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול יעיל לייצור השיבוטים תא T האנושיים שדווקא מגיבים לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד. הפרוטוקול חל pMHC (HLA) תיוג והעשרת multimer לבידוד של תאי T האנושיים alloantigen הספציפי עם cytometry זרימת תא מיון ושיטה חזקה לתרבות במבחנה של תאי T אנושיים כדי לאפשר ייצור של שיבוטים תא T מהתאים ממוינים אחת ( סקירה באיור 1).

<table><tbody><tr><td>Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS, 1x without Ca or Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophore-labeled pMHC tetramer</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Biotin Selection Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Selection magnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Human Fc blocking solution</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s DMEM, without b-ME or L-glutamine</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum, male donor</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life Technologies</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell sorting buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human T Cell Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove&#039;s DMEM</td><td>351.6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated human AB serum</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>0.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoethanol (14.3 M)</td><td>1.4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human alloantigen-specific t cells from peripheral blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

פרוטוקול זה מתאר את הדור של תרביות תאי T אנושיות משובט עם מוגדר alloantigen ספציפי באמצעות העשרה מגנטית חרוז וזרימת תא בודד cytometry מיון אסטרטגיה. איור 1 מספק קווי המתאר של התהליך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52257/5...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood at JoVE.com

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.9K Views.  University of California, San Diego. This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Video: Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)1. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD5, 6. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production6, 7and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells8and CD4 T regulatory cells9.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals10.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro11. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation12. Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

This paper describes a simple technique to induce alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells. The technique can be applied clinically to generate non-alloreactive donor cells. Infusion of these cells could improve immune reconstitution and reduce toxicity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

אינדוקציה של Anergy Alloantigen ספציפיים בתוך האדם תאים דם היקפיים mononuclear על ידי גירוי Alloantigen עם המצור Co-גירוי אותות

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Cancer Research

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Biology

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

ובידוד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות של Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

<meta charset="utf8"></head><body>יצירת שיבוטים של תאי T רגולטוריים אנושיים

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

יצירת שיבוטים של תאי T רגולטוריים אנושיים

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video