הערכת יעילותן של חומצות פרוקסי אורגניות למיגור ביופילמים חלביים בגישה המשלבת שיטות סטטיות ודינמיות

מיקרואורגניזמים יוצרי ביופילם הם נושא מרכזי בתעשיית המזון, כולל תעשיית החלב. בגלל ההשפעה השלילית שלהם על איכות המוצרים, אז חשוב לפתח אסטרטגיות בקרת ביופילם. גישה זו משלבת שיטת סינון סטטית בתפוקה גבוהה ושיטה דינמית המחקה תנאים באתרם.

שתי שיטות אלה משלימות זו את זו לחקר יעילותם של חומרי חיטוי נגד ביופילמים. ניתן להשתמש בגישה זו כדי לבחון פורמולציות ביולוגיות או כימיות חדשות לבקרת ביופילמים במגזרי המזון, הרפואה או הסביבה. התחל על ידי מערבול צינורות תרבית חיידקים Pseudomonas azotoformans.

להעביר באופן אספטי 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים לתוך 10 מיליליטר של מרק סויה טריפטי סטרילי או TSB בינוני כדי להשיג את הריכוז הסופי של כ פעמיים 10 עד CFU השביעי למיליליטר. מערבול צינור התרבית. לאחר מכן באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 מיקרוליטר של תרבית חיידקים מדולל בארות צלחת microtiter biofilm ב triplicate.

עומס 150 מיקרוליטר של TSB בינוני לתוך שלוש בארות חדשות כבקרה. לאחר מכן, לדגור על צלחת microtiter biofilm ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ללא תסיסה. נקו וייבשו באוויר את חלקי הביוריאקטור לפני שתניחו את הלהב השטוח בתוך זכוכית של ליטר אחד המחוברת למחזיק באמצעות מוט מגנטי.

שמרו על התקנה זקופה באמצעות מוט הפלסטיק המחובר לצד הפנימי של מכסה הביוריאקטור. השתמש במברג כדי להניח את הקופונים או שקופיות הנירוסטה על מוטות הפוליפרופילן שלהם. הכניסו קופונים או מחליקים לתוך החורים במכסה מבלי להניח את פיני היישור שלהם בחריצים המאפשרים לאדים לברוח במהלך העיקור.

כסו את כל פתחי האוורור בנייר אלומיניום ועטפו את שאר הציוד, כלומר צינורות בגודל 18 וצינורות בגודל 16, בלם זרימת הזכוכית, מכסי המיכלים, המברגים, המלקחיים ומסנני 0.2 מיקרומטר ברדיד אלומיניום. Autoclave, הביוריאקטור שהוקם במחזור יבש בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כדי לבצע את השלב הראשון של היווצרות הביופילם בביוריאקטור במצב אצווה, בתוך ארון בטיחות ביולוגי, חבר קצה אחד של צינורות בגודל 18 לפיית היציאה של הביוריאקטור ושמור את הקצה השני עטוף ברדיד אלומיניום.

הסר קופון אחד או מחזיק שקופיות אחד ממכסה הביוריאקטור והכנס אותו לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. לאחר מכן באמצעות פיפטה סרולוגית של 50 מיליליטר, ממלאים את הביוריאקטור ב 340 מיליליטר של 300 מיליגרם למיליליטר TSB בינוני דרך החור שנכבש על ידי המוט. כדי לחסן את מדיום התרבית בביוריאקטור, הוסף מיליליטר אחד של 10 ל- CFU השמיני למיליליטר Pseudomonas azotoformans תמיסה חיידקית דרך הפתח באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר והחזיר את המוט למקומו המקורי.

מקם את המוטות שכבר הונחו בחורי המכסה כדי שהפינים יתאימו לחריצים המתאימים. לאחר מכן מניחים מסנן טיהור אוויר חיידקי 0.2 מיקרומטר בקצה הצינור בקוטר הקטן ביותר הממוקם על מכסה הביוריאקטור. הצינור השני באותו קוטר נשאר מחובר באופן קבוע עם מכסה בורג מתכת או תקע סיליקון שנסגר בחוזקה.

מניחים את הביוריאקטור למשך 24 שעות מעל פלטת החימום המוגדרת לטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ומערבבים במהירות של 130 סל"ד. לאחר 24 שעות, בצע את השלב השני של היווצרות הביופילם בביוריאקטור במצב זרימה רציפה. הניחו קארבוי המכיל 18 ליטר מים מזוקקים סטריליים בארון הבטיחות הביולוגית.

לאחר מכן להוסיף שני ליטר של 1000 מיליגרם לליטר TSB תרבית בינוני כדי לקבל ריכוז סופי של 100 מיליגרם לליטר. מכסים את המיכל במכסה הסטרילי שלו שאליו מחוברים שני צינורות. הראשון הוא צינור סיליקון המקובע בממשק הפקק כדי לשאוב את המדיום.

השני, צינור בגודל 16, מחובר ליציאה החיצונית ומאפשר לנוזל לזרום לכיוון הביוריאקטור. לאחר חיבור הצינור בגודל 16 לקצה בלם זרימת הזכוכית, הכנס את האחרון לצינור הגדול ביותר על מכסה הביוריאקטור בקצה השני שלו ולאחר מכן התקן את הצינור בגודל 16 במשאבה הפריסטלטית. השתמש עוד 20 ליטר carboy כדי לאסוף את השפכים מן bioreactor.

חבר את קצה הצינור המחובר לפיית מוצא הביוריאקטור למכסה מיכל הפסולת. הכנס מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך הצינור הנוכחי על המכסה של מיכל זה. לאחר שתסיים, הפעל את המשאבה הפריסטלטית בקצב זרימה של 11.3 מיליליטר לדקה והשאר את המערכת פועלת למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות, כבו את המשאבה הפריסטלטית והפסיקו לערבב ולחמם את הביוריאקטור. כדי לשחזר את הביופילם החיידקי, שטפו את הקופונים או השקופיות ב-40 מיליליטר של PBS כדי לחסל חיידקים פלנקטוניים. לאחר מכן שחררו אותם לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר של PBS.

לאחר 30 שניות של מערבולת, סוניק את הצינורות במהירות של 40 קילוהרץ למשך 30 שניות. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. לאחר שתסיים, אסוף את 40 מיליליטר של תרחיף ביופילם בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר ושטוף את הקופונים או המגלשות עם שניים של תמיסת PBS סטרילית.

לשחזר את נוזל שטיפה זה ולהוסיף אותו השעיה biofilm כבר נאסף. מוציאים את צלחת המיקרוטיטר מ-30 מעלות צלזיוס. הוסף 200 מיקרוליטר של PBS לשלוש בארות של מיקרו-צלחת של 96 בארות.

כדי לשטוף את הביופילמים ולחסל חיידקים פלנקטוניים, העבירו את מכסה המיקרו-צלחת של הביופילם עם ביופילמים שנוצרו על היתדות למיקרו-צלחת בת 96 בארות המכילה את PBS למשך 10 שניות. הכינו את חומרי החיטוי בריכוזים הנדרשים והוסיפו 200 מיקרוליטר מכל ריכוז חומר חיטוי לבארות של צלחת מיקרוטיטר חדשה בת 96 בארות במשולש. מעבירים את מכסה צלחת המיקרוטיטר של הביופילם על צלחת 96 המכילה את חומרי החיטוי ודגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר לזמן החשיפה הרצוי.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מרק מנטרל Dey-Engley לבארות של צלחת מיקרוטיטר חדשה של 96 בארות. מעבירים את המכסה של צלחת מיקרוטיטר הביופילם לצלחת מיקרוטיטר 96 בארות המכילה את המרק המנטרל. אטמו את צלחת המיקרוטיטר עם פרפילם והניחו אותה בסוניקטור האמבטיה ב 40 קילוהרץ למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, מהעמודה הראשונה של הצלחת הסוניקטיבית, העבירו 100 מיקרוליטר של ביופילמים מנותקים לשורה הראשונה של צלחת מיקרוטיטר חדשה בת 96 בארות. לאחר מכן הוסף 180 מיקרוליטר של PBS סטרילי לצלחת 96 באר למעט השורה הראשונה. לאחר מכן, להעביר 20 מיקרוליטר של תמיסת ביופילם מהשורה הראשונה לבארות בשורה השנייה המכילה 180 מיקרוליטר של PBS כדי להשיג דילול 10 למינוס אחד.

לאחר מכן להעביר 20 מיקרוליטר מהשורה השנייה לבארות בשורה הבאה כדי להשיג דילול של 10 למינוס שתיים. חזור על כך כדי לקבל דילול בין 10 למינוס חמש ו -10 למינוס שבע. לחסן 100 מיקרוליטר של הדילול הרצוי על TSA ולדגור על הצלחות בהתאם לפרמטרי הגידול של החיידק.

צור את Pseudomonas azotoformans PFLA 1 biofilms על הקופונים בביוריאקטור, להסיר את המוט מחזיק את הקופונים ולשטוף את המוט בתוך צינור חרוטי המכיל 30 מיליליטר של PBS כדי להסיר תאים פלנקטוניים. זרקו כל קופון לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר באמצעות מברג. לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של תמיסת peroxyacid אורגנית המתאימה או PBS עבור הבקרה.

לאחר חמש דקות של דגירה, מוסיפים 36 מיליליטר של מרק מנטרל Dey-Engli. לאחר ערבול הצינור החרוטי במשך 30 שניות, סוניק אותם במהירות של 40 קילוהרץ למשך 30 שניות. חזור על התהליך שלוש פעמים כדי לקבל את השעיית הביופילם.

חזור על אותו הליך עם המוטות האחרים, הכין אשליות סדרתיות של השעיית הביופילם, ולוחית את המתלה על מדיום TSA כפי שתואר קודם לכן. ניתוח SCM הראה את נוכחותו של הביופילם על ידי Pseudomonas azotoformans PFL1A על יתדות מיקרו-לוחות הביופילם. הביופילם Pseudomonas azotoformans PFL1A שנוצר על מגלשת נירוסטה באמצעות ביוריאקטור נראה צפוף מאוד והציג את המאפיינים המורפולוגיים של ביופילם תלת ממדי בוגר.

תוצאות ספירת החיידקים של הביופילמים שפותחו על ידי מבודד זה במערכת הדינמית הראו צפיפות תאים משמעותית המתאימה ל-8.74 לוג CFU לסנטימטר רבוע בתווך תרבית TSB ו-7.86 לוג CFU סנטימטר רבוע בחלב רזה סטרילי. התוצאות שהתקבלו עם B.vesicularis isolate הראו כי העלייה בריכוז החומרים המזינים מ 100 ל 900 מיליגרם לליטר הביאה לעלייה בספירת החיידקים של הביופילמים מ 6.11 ל 8.71 לוג CFU סנטימטר מרובע. כמו כן, צמיחה משמעותית בביופילם נצפתה כאשר קצב הזרימה הופחת ל -6.0 מיליליטר לדקה, מה שמצביע על כך שגורמים מסוימים יכולים להשפיע על היווצרות ביופילם בביוריאקטור.

אף אחד מהביופילמים לא הכיל תאים ברי קיימא הניתנים לזיהוי בזמן מגע של חמש דקות ב-500 חלקים למיליון עם חומצות פרוקסי אורגניות ו-100,000 חלקים למיליון עם ריכוזי מי חמצן של חומרי חיטוי המיושמים בדרך כלל במפעלי חלב. ה-SCM הראה את המבנה התלת-ממדי של ריכוז מיגור ביופילם מינימלי לא מטופל או ביופילמים של MBEC, בעוד שהביופילמים של MBEC שטופלו איבדו את הקונפורמציה התלת-ממדית שלהם. חיוני להישאר במצב סטרילי בעת ביצוע פרוטוקול זה.

כמו כן, על המשתמש לזכור כי התוצאה שנוצרה קשורה לבידוד וחיטוי ייחודיים. שילוב של חומר חיטוי עם רטט מכני, אולטרסאונד או טיפולים אנזימטיים יכול להיות מוערך כדי לשפר את היעילות של מיגור ביופילם. גישה זו, תוך שימוש בשיטות סטטיות ודינמיות ליצירת ביופילמים, סללה את הדרך לחוקרים לסנן ולחקור נוסחאות אנטי-ביופילם חדשות כדי לשלוט טוב יותר בביופילמים במגזרים שונים.