שיטה זו מתאימה להדמיה חיה של דינמיקה ציטופלסמית באמצעות תמציות ביצי צפרדע, ומאפשרת לחקור מידע על תבניות מרחביות בציטופלסמה. ניתן לעצב דגימות לשכבה בעובי אחיד וניתן לכוונון, ולהצטלם על פני שדה דו-ממדי או אמצעי אחסון תלת-ממדי. שיטה זו היא חסכונית וקלה ליישום.
התחל על ידי החלת שכבה של סרט דבק FEP על שקופית זכוכית עם אפליקטור רולר. חותכים סרט הדבקה מוגזם על הקצוות בעזרת סכין גילוח נקי. לאחר מכן, הכינו תלושי כיסוי מצופים בנייר דבק FEP באותו אופן.
לאחר מכן החל מרווח הדמיה דביק דו-צדדי על הצד המצופה בנייר דבק FEP של המגלשה והותיר את תוחם המגן ללא כיסוי. מעבירים ביצים לכוס זכוכית של 400 מיליליטר ומסירים כמה שיותר חיץ מטיל ביצים על ידי דקנטינג. לאחר מכן לדגור את הביצים ב 100 מיליליטר של פתרון dejellying מוכן טרי בעדינות לסובב אותם.
לאחר כשלוש דקות, לשפוך את הפתרון ולהוסיף 100 מיליליטר של תמיסת dejellying טרי. ממשיכים את הדגירה עד שהביצים ארוזות היטב, אך הימנעו מהשארת ביצים בתמיסת הפסולת למשך יותר מחמש דקות בסך הכל. לאחר הדגירה, להסיר את תמיסת dejellying ככל האפשר ולשטוף את הביצים במאגר MMR 0.25x.
מערבבים את הביצים, ואז שופכים את החיץ. חוזרים על הפעולה כמה פעמים עד שמשתמשים בסך הכל בליטר אחד של החיץ לשטיפה. לאחר מכן, לשטוף את הביצים כמה פעמים עם סך של 400 מיליליטר של ביצה lysis buffer, הסרת ביצים חריגות בין שטיפות.
לאחר מכן השתמש בפיפטה העברה עם קצה חתך רחב כדי להעביר את הביצים לצינור צנטריפוגה תחתון עגול של 17 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ תזה של ביצה. סובבו את הצינור בצנטריפוגה קלינית במשקל 400 גרם למשך 15 שניות כדי לארוז את הביצים. לאחר מכן להסיר כמה שיותר של חיץ תזה ביצה באמצעות פיפטה פסטר.
קבע את הנפח המשוער של הביצים הארוזה. לאחר מכן להוסיף חמישה מיקרוגרם למיליליטר כל אחד של אפרוטינין, leupeptin ו cytochalasin B ו 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר של cyclohexamide ישירות על גבי הביצים הארוזה. לרסק את הביצים על ידי centrifusing את הצינור במשך 15 דקות ב 12, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד.
לאחר מכן, חבר מחט 18 מד למזרק. כאשר שיקוע קצה המחט פונה כלפי מעלה לנקב את הצינור מהצד בתחתית השכבה הציטופלסמית ולשחזר את התמצית על ידי ציור איטי. מעבירים את התמצית הציטופלסמית המשוחזרת לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ושומרים אותה על הקרח.
כאשר אתם מוכנים לתמונה, השלימו את התמצית עם הריאגנטים הרצויים ובדיקות הדמיה פלואורסצנטיות. הסר את תוחם המגן העליון ממרווח ההדמיה על המגלשה המוכנה והפקיד כשבעה מיקרוליטרים של תמצית במרכז הבאר. יש למרוח מיד את הכיסוי המצופה בנייר דבק FEP כאשר צד ה-FEP פונה לתמצית כדי לאטום את הבאר ולהמשיך במהירות להדמיה.
הנח את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך או זקוף עם במה ממונעת ומצלמה דיגיטלית. צלמו את החלצות במיקומים המרחביים הרצויים במרווחי זמן הן בערוצי שדה בהיר והן בתעלות פלואורסצנטיות. כאן מוצג ניסוי בהילוך מהיר תוך שימוש בתמציות ביצים של xenopus laevis כדי לחקור את הארגון העצמי של הציטופלסמה במהלך אינטרפאזה.
לאחר כ-20 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר נראו אזורים שהתרוקנו מאור מפזר רכיבים ציטופלסמיים הן בשדה הבהיר והן בתעלות המיטוכונדריה. בטמפרטורת החדר של כ-60 דקות, יש לבסס היטב תבנית מרחבית המורכבת מתאים דמויי תאים, כאשר מיקרוטובולים יוצרים מבנה חלול דמוי זר ומיטוכונדריה מחולקת בבירור לכל תא. השוואה של ביצועי התמצית בתאי הדמיה עם ובלי קלטות FEP על זכוכית מוצגת כאן.
בתא העשוי מזכוכית מודבקת FEP התמצית מאורגנת בעצמה לתבניות רגילות דמויות תאים. בתא שבו משטחי הזכוכית לא כוסו על ידי סרט ה-FEP, התמצית הראתה תבניות חריגות של שדה בהיר ומיקרוטובולים שהשתבשו יותר ויותר עם הזמן. לא נצפו הבדלים משמעותיים ביבוא הגרעיני של חלבון GST-mCherry-NLS.
הדברים החשובים שיש לזכור הם להעביר את משטחי הזכוכית עם סרט הדבקה FEP ולהסיר את כל הביצים הרעות במהלך הכנת החילוץ. בעזרת מערכת זו אנו יכולים לשלוט בקלות בעובי דגימת החילוץ, ובכך לסלול את הדרך להדמיית תבניות ציטופלסמיות בתלת-ממד, באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור.
