שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית או EAE היא מודל חייתי המשמש לפיתוח טיפולים חדשים ומשופרים לחולי טרשת נפוצה. גרימת מחלות ב-EAE דורשת תחליב שמן ומים מושלם כדי להשיג תוצאות עקביות. שיטת הכנת האמולסיה המוצגת כאן נקייה מהשפעה אנושית, ובכך מגבילה את חוסר העקביות מניסוי אחד למשנהו.

למרות שהשיטה הותאמה ל-EAE, ניתן להשתמש בה גם למודלים אחרים של מחלות אוטואימוניות וגם לבדיקת חיסונים לסרטן. כדי להכין את slurry CFA ב 100 מיליגרם של שחפת M מיובש בהקפאה H37 RA וחמישה, 3.2 מילימטרים חרוזי פלדה לצינור שבעה מיליליטר. לנער את הצינור בהומוגנייזר במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר.

הוסף חמישה מיליליטר של אדג'ובנט IFA לצינור ונער שוב במשך 60 שניות במהירות הגבוהה ביותר. לאחר מכן מעבירים את החרוזים לצינור טרי עם פיפטה שמשאירה את החרוזים מאחור ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. כדי להכין תחליב CFA/פפטיד, הורד קובץ משלים אחד כדי לחשב את הכמות הדרושה עבור כל מגיב.

לאחר מכן הניחו את הצינור המכוסה בבורג ואת הריאגנטים לשימוש על קרח. לאחר מכן, הוסף את רכיבי האמולסיה. תחילה PBS, אחר כך הפפטיד, ה- CFA slurry.

ולבסוף, IFA. סגור את הצינור עם המכסה בחוזקה על ידי הידוק ושחרור אותו מספר פעמים. יש לנער את השפופרת במרץ במשך 5 עד 10 שניות ביד כדי לערבב מראש את הריאגנטים.

מניחים את הצינור בהומוגנייזר הרועד ומהדקים אותו באמצעות המוט. הגדר את המהירות להגדרה הגבוהה ביותר ואת הזמן ל- 60 שניות. לאחר סיום הריצה, הניחו את הצינור על הקרח במשך שלוש דקות וחזרו על הריצה פעם או פעמיים נוספות עם אותן הגדרות.

צנטריפוגה את הצינור ב 300 G מדקה אחת כדי להסיר אוויר לכוד לדחוס את האמולסיה. הסר את המכסה מהצינור. הכנס את הבוכנה לתוך הצינור, ודחף אותה למטה לאט עד שהיא מגיעה לחלק העליון של התחליב.

הסר את מארז ההצמדה בתחתית הצינור על ידי סיבובו. לאחר מכן, הסר את הבוכנה מכל מזרקי ההזרקה והוסף מחט למזרקי ההזרקה. לאחר מכן חברו את גב מזרק ההזרקה למנעול הייעודי בתחתית הצינור ונעלו אותו עם טוויסט קצר.

העבר את האמולסיה מהצינור למזרק ההזרקה על ידי דחיפת הבוכנה בעדינות. עצור כאשר תחליב מגיע 0.15 מיליליטר סיום של מזרק ההזרקה. הפרידו את מזרק ההזרקה מהצינור והכניסו את הבוכנה בזהירות תוך הקפדה על כך ששום אוויר לא ייכנס למזרק זה.

דוחפים את הבוכנה עד שהתחליב יוצא מהמחט וחוזרים על התהליך למשך שארית התחליב הקיים בצינור. כדי לנתח את גודל חלקיקי המים והשמן הוסיפו טיפה זעירה של האמולסיה למגלשה במיקרוסקופ, מרחו אותה באמצעות כיסוי ולאחר מכן דחפו חזק בתנועה מעגלית כדי לשטח את התחליב. בחנו את האמולסיה המרוחה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה עם הגדלה של פי 400 והתמקדו בשדה עם חד-שכבתי של התחליב.

ודא שחלקיקים קטנים, אחידים, אפורים או לבנים נראים לעין. תחליבים שנוצרו בשיטת ההומוגניזציה הציגו חלקיקים אפורים או לבנים בצורת שעועית המייצגים טיפות זעירות של מים ותחליבי שמן. לעומת זאת, טיפות האמולסיה שיוצרו בשיטת המזרק היו גדולות ורחבות יותר.

בשיטת המערבולת נצפו חלקיקים אפורים או שחורים גדולים המתאימים לבועות אוויר שנלכדו בתחליב. שינויים בפיזור גודל החלקיקים לאורך זמן שנמדדו באמצעות מנתח גודל חלקיקי שבירה בלייזר עבור תחליבי מים ושמן לא הראו כל שינוי בגודל החלקיקים במשך תקופה של שישה שבועות. התחליבים הטריים בני 3 שבועות ו-15 שבועות גרמו כולם למחלות EAE דומות בכל בעלי החיים שנוסו במהלך הניסוי.

עכברים פיתחו דפוס מחלה דומה בכל הניסויים שגילו כי שיטת ההומוגניזציה המוצגת כאן ייצרה אמולסיות שגרמו ל-EAE באופן עקבי וניתן לשחזור. לפני הכנת האמולסיה לניסוי, הורד קובץ משלים מספר אחת כדי לחשב את הכמות של כל רכיב הדרושה כדי למזער את הפסולת. השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש לסטנדרטיזציה של הכנת תחליב לא רק למחקר פרה-קליני, אלא גם בעתיד להכנת חיסונים לסרטן במרפאה.