A encefalomielite autoimune experimental ou EAE é um modelo animal usado para desenvolver tratamentos novos e aprimorados para pacientes com esclerose múltipla. Induzir doenças em EAE requer uma emulsão perfeita de óleo e água para alcançar resultados consistentes. O método de preparação da emulsão aqui apresentado é livre da influência humana, limitando assim as inconsistências de um experimento para outro.
Embora o método tenha sido otimizado para EAE, ele também pode ser usado para outros modelos de doenças autoimunes e também para testar vacinas contra o câncer. Para preparar a pasta CFA a 100 miligramas de M tuberculosis H37 RA liofilizada e cinco esferas de aço de 3,2 milímetros para um tubo de sete mililitros. Agite o tubo no homogeneizador durante 60 segundos à velocidade mais elevada.
Adicione cinco mililitros de adjuvante IFA ao tubo e agite novamente durante 60 segundos à velocidade mais alta. Em seguida, transfira a pasta para um tubo fresco com uma pipeta deixando as contas para trás e armazene a quatro graus Celsius até o uso. Para preparar uma emulsão CFA/Peptídeo, baixe o arquivo suplementar um para calcular a quantidade necessária para cada reagente.
Em seguida, coloque o tubo tampado por parafuso e os reagentes a serem usados no gelo. Em seguida, adicione os componentes de emulsão. Primeiro PBS, depois o peptídeo, a pasta CFA.
E, finalmente, a IFA. Feche o tubo com a tampa firme, apertando-o e soltando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente durante 5 a 10 segundos à mão para pré-misturar os reagentes.
Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 segundos. Quando a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por três minutos e repita a corrida mais uma ou duas vezes com as mesmas configurações.
Centrifugar o tubo a 300 G a partir de um minuto para remover o ar preso e compactar a emulsão. Remova a tampa do tubo. Insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão.
Remova o invólucro de encaixe na parte inferior do tubo torcendo-o. Em seguida, remova o êmbolo de todas as seringas de injeção e adicione uma agulha às seringas de injeção. Em seguida, prenda a parte de trás da seringa de injeção à fechadura dedicada na parte inferior do tubo e trave-a com uma torção curta.
Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injeção, empurrando o êmbolo suavemente. Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 mililitros da seringa de injeção. Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo cuidadosamente tomando cuidado para que nenhum ar entre nesta seringa.
Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha e repita o processo para o resto da emulsão presente no tubo. Para analisar o tamanho das partículas de água e óleo, adicione uma pequena gota da emulsão a uma lâmina de microscópio, espalhe-a com um deslizamento de tampa e, em seguida, empurre com força em um movimento circular para achatar a emulsão. Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase com ampliação de 400 vezes e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão.
Certifique-se de que partículas pequenas, uniformes, cinzas ou brancas estejam visíveis. As emulsões produzidas pelo método de homogeneização exibiam partículas em forma de feijão cinza ou branco representando minúsculas gotículas de emulsões de água e óleo. Em contraste, as gotículas de emulsão produzidas usando o método da seringa eram maiores e mais largas.
No método do vórtice, grandes partículas cinza ou pretas foram observadas correspondendo a bolhas de ar presas na emulsão. Mudanças na distribuição do tamanho das partículas ao longo do tempo medidas usando um analisador de tamanho de partícula de desfração a laser para emulsões de água e óleo não mostraram nenhuma mudança no tamanho das partículas durante um período de seis semanas. As emulsões frescas de 3 semanas e 15 semanas de idade induziram doenças EAE semelhantes em todos os animais testados ao longo do experimento.
Os camundongos desenvolveram um padrão de doença semelhante em todos os experimentos, revelando que o método de homogeneização aqui apresentado produziu emulsões que induziram EAE de maneira consistente e reprodutível. Antes de fazer a emulsão para um experimento, baixe o arquivo suplementar número um para calcular a quantidade de cada componente necessária para minimizar o desperdício. O método aqui apresentado poderia ser usado para padronizar a preparação da emulsão não apenas para pesquisas pré-clínicas, mas também no futuro para preparar vacinas contra o câncer na clínica.
