실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

실험적 자가면역 뇌척수염 또는 EAE는 다발성 경화증 환자에 대한 새롭고 개선된 치료법을 개발하기 위해 사용되는 동물 모델이다. EAE에서 질병을 유도하려면 일관된 결과를 얻기 위해 완벽한 오일 및 물 에멀젼이 필요합니다. 여기에 제시된 에멀젼 제조 방법은 인간의 영향을받지 않으므로 한 실험에서 다른 실험으로의 불일치를 제한합니다.

이 방법은 EAE에 최적화되었지만 다른자가 면역 질환 모델 및 암 백신 테스트에도 사용할 수 있습니다. CFA 슬러리를 100 밀리그램의 동결건조된 M 결핵 H37 RA 및 5개, 3.2 밀리미터 스틸 비드를 7 밀리리터 튜브로 제조하였다. 최고 속도 설정에서 60 초 동안 균질 기의 튜브를 흔 듭니다.

튜브에 5 밀리리터의 IFA 보조제를 넣고 최고 속도로 60 초 동안 다시 흔 듭니다. 그런 다음 슬러리를 피펫으로 새 튜브로 옮기고 비드를 남기고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. CFA/펩타이드 에멀젼을 준비하려면 보충 파일 1을 다운로드하여 각 시약에 필요한 양을 계산하십시오.

그런 다음 스크류 캡핑 튜브와 사용할 시약을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로 에멀젼 성분을 첨가하십시오. 먼저 PBS, 이어서 펩타이드, CFA 슬러리.

마지막으로 IFA입니다. 튜브를 여러 번 조이고 풀어 캡으로 단단히 닫습니다. 시약을 미리 혼합하기 위해 손으로 5-10초 동안 튜브를 세게 흔듭니다.

튜브를 흔들리는 균질화기에 넣고 막대로 고정합니다. 속도를 최고 설정으로 설정하고 시간을 60초로 설정합니다. 달리기가 끝나면 튜브를 얼음 위에 3 분 동안 놓고 동일한 설정으로 한두 번 더 달리기를 반복하십시오.

튜브를 300G에서 1분에서 원심분리하여 갇힌 공기를 제거하고 에멀젼을 압축합니다. 튜브에서 캡을 제거하십시오. 플런저를 튜브에 삽입하고 에멀젼 상단에 도달 할 때까지 천천히 아래로 누릅니다.

튜브 바닥에 있는 스냅 오프 인클로저를 비틀어 제거합니다. 다음으로 모든 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기에 바늘을 추가합니다. 그런 다음 주사기 뒷면을 튜브 바닥의 전용 잠금 장치에 부착하고 짧게 비틀어 잠급니다.

플런저를 부드럽게 밀어 튜브에서 주입 주사기로 에멀젼을 옮깁니다. 에멀젼이 주사기의 0.15 밀리리터 눈금에 도달하면 중지하십시오. 튜브에서 주사기를 분리하고 이 주사기에 공기가 들어가지 않도록 주의하면서 플런저를 조심스럽게 삽입합니다.

에멀젼이 바늘에서 나올 때까지 플런저를 밀고 튜브에 존재하는 나머지 에멀젼에 대해 이 과정을 반복합니다. 물과 기름 입자의 크기를 분석하려면 현미경 슬라이드에 에멀젼의 작은 방울을 추가하고 커버 슬립으로 번진 다음 원을 그리며 세게 밀어 에멀젼을 평평하게 만듭니다. 400배 배율의 위상차 현미경으로 얼룩진 에멀젼을 검사하고 에멀젼의 단층이 있는 필드에 초점을 맞춥니다.

작고 균일 한 회색 또는 흰색 입자가 보이는지 확인하십시오. 균질화 방법에 의해 생성 된 에멀젼은 물과 오일 에멀젼의 작은 방울을 나타내는 회색 또는 흰색 콩 모양의 입자를 표시했습니다. 대조적으로, 주사기 방법을 사용하여 생성 된 에멀젼 방울은 더 크고 넓었다.

와류 방법에서, 에멀젼에 갇힌 기포에 상응하는 큰 회색 또는 검은 색 입자가 관찰되었다. 물 및 오일 에멀젼에 대한 레이저 굴절 입자 크기 분석기를 사용하여 측정한 시간 경과에 따른 입자 크기 분포의 변화는 6주 동안 입자 크기의 변화를 나타내지 않았습니다. 신선한 3주령 및 15주령의 에멀젼은 모두 실험 전반에 걸쳐 시험된 모든 동물에서 유사한 EAE 질환을 유도하였다.

마우스는 모든 실험에서 유사한 질병 패턴을 개발하여 여기에 제시된 균질화 방법이 일관되고 재현 가능한 방식으로 EAE를 유도하는 에멀젼을 생성한다는 것을 밝혔습니다. 실험을 위해 에멀젼을 만들기 전에 보충 파일 번호 1을 다운로드하여 낭비를 최소화하는 데 필요한 각 구성 요소의 양을 계산하십시오. 여기에 제시된 방법은 전임상 연구뿐만 아니라 향후 클리닉에서 암 백신을 준비하기 위해 에멀젼 제제를 표준화하는 데 사용될 수 있습니다.