Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит или EAE - это животная модель, используемая для разработки новых и улучшенных методов лечения пациентов с рассеянным склерозом. Индуцирование заболевания в EAE требует идеальной масляной и водной эмульсии для достижения последовательных результатов. Представленный здесь способ получения эмульсии свободен от влияния человека, тем самым ограничивая несоответствия от одного эксперимента к другому.
Несмотря на то, что метод был оптимизирован для EAE, он также может быть использован для другой модели аутоиммунных заболеваний, а также для тестирования противораковых вакцин. Для приготовления Суспензии CFA на 100 миллиграммах сублимированного M tuberculosis H37 RA и пяти, 3,2 миллиметровых стальных шариках до семимиллилитровой трубки. Встряхните трубку в гомогенизаторе в течение 60 секунд при максимальной скорости.
Добавьте пять миллилитров адъюванта IFA в трубку и снова встряхните в течение 60 секунд на самой высокой скорости. Затем переложите суспензию в свежий тюбик с пипеткой, оставив бусины, и храните при четырех градусах Цельсия до использования. Чтобы приготовить эмульсию CFA/Peptide, загрузите дополнительный файл для расчета количества, необходимого для каждого реагента.
Затем поместите завинчиваемую трубку и реагенты для использования на льду. Далее добавьте компоненты эмульсии. Сначала PBS, затем пептид, суспензия CFA.
И, наконец, IFA. Плотно закройте трубку колпачком, затянув и ослабив ее несколько раз. Энергично встряхните трубку в течение 5-10 секунд вручную, чтобы предварительно смешать реагенты.
Поместите трубку в встряхивающий гомогенизатор и закрепите ее стержнем. Установите максимальную настройку скорости и время 60 секунд. Как только пробег будет завершен, поместите трубку на лед на три минуты и повторите пробежку еще один или два раза с теми же настройками.
Центрифугируйте трубку при 300 G в течение одной минуты, чтобы удалить захваченный воздух и уплотнить эмульсию. Снимите колпачок с трубки. Вставьте плунжер в трубку и медленно толкайте его вниз, пока он не достигнет верхней части эмульсии.
Снимите защелкивающийся корпус в нижней части трубки, скрутив его. Затем снимите поршень со всех инъекционных шприцев и добавьте иглу к инъекционным шприцам. Затем прикрепите заднюю часть инъекционного шприца к специальному замку в нижней части трубки и зафиксируйте его коротким поворотом.
Перенесите эмульсию из трубки в шприц для инъекций, осторожно толкнув плунжер. Прекращается, когда эмульсия достигает 0,15 миллилитра градуировки инъекционного шприца. Отделите инжекционный шприц от трубки и вставьте поршень, тщательно следя за тем, чтобы воздух не попадал в этот шприц.
Толкайте плунжер до тех пор, пока эмульсия не выйдет из иглы, и повторите процесс для остальной части эмульсии, присутствующей в трубке. Чтобы проанализировать размер частиц воды и масла, добавьте крошечную каплю эмульсии на предметное стекло микроскопа, смажьте ее скольжением крышки, а затем сильно надавите круговыми движениями, чтобы сгладить эмульсию. Исследуйте смазанную эмульсию под фазово-контрастным микроскопом с 400-кратным увеличением и фокусируйтесь на поле с монослоем эмульсии.
Убедитесь, что видны мелкие, однородные, серые или белые частицы. Эмульсии, полученные методом гомогенизации, отображали серые или белые бобообразные частицы, представляющие собой мельчайшие капли водных и масляных эмульсий. Напротив, капли эмульсии, полученные с использованием шприцевого метода, были больше и шире.
В вихревом методе наблюдались крупные серые или черные частицы, соответствующие пузырькам воздуха, захваченным в эмульсии. Изменения в распределении частиц по размерам с течением времени, измеренные с помощью лазерного дефракционного анализатора размера частиц для водных и масляных эмульсий, не показали каких-либо изменений в размере частиц в течение шести недель. Свежие эмульсии 3-недельного и 15-недельного возраста индуцировали аналогичные заболевания EAE у всех животных, протестированных на протяжении всего эксперимента.
Мыши развили аналогичную картину заболевания во всех экспериментах, показывающих, что метод гомогенизации, представленный здесь, производил эмульсии, которые индуцировали EAE последовательным и воспроизводимым образом. Прежде чем сделать эмульсию для эксперимента, загрузите дополнительный файл номер один, чтобы рассчитать количество каждого компонента, необходимого для минимизации отходов. Представленный здесь метод может быть использован для стандартизации препарата эмульсии не только для доклинических исследований, но и в дальнейшем для приготовления противораковых вакцин в клинике.
