0. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה אופטימלית וניתנת לשחזור ליצירת אוסטאוקלסט במבחנה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס תהליך ההבחנה והפונקציונליות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר מספר גבוה של אוסטאוקלסטים פעילים פונקציונלית בתוך שבוע בלבד. תפוקת התמיינות גבוהה מושגת על ידי שימוש במונוציטים מטוהרים והוספת ציטוקינים בזמן.
אוסטאוקלסטים אחראים להרס עצם בכל צורה של דלקת פרקים, ושיטה זו מספקת את הכלים לסנן תרכובות טיפוליות חדשניות שיכולות לווסת את ההתמיינות שלהם, ו / או תפקודים. מי שתדגים את ההליך תהיה פטרישיה רידלובה, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, לבודד את PBMCs על ידי העברת הדם לתוך צינור 50 מיליליטר חדש.
לדלל אותו עם PBS סטרילי בנפח שווה עבור דם טרי, או יחס של 1: 3 עבור קונוסים לויקוציטים ומעילים באפי. מערבבים בעדינות את הדם בהיפוך. הכינו צינורות של 15 מיליליטר המכילים שלושה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות, ולאט לאט שכבו שמונה עד 10 מיליליטר של דם מדולל בחלק העליון של מדיום שיפוע הצפיפות, תוך הימנעות מערבוב.
צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם. לאחר מכן יש להשליך בזהירות את השכבה העליונה עם פיפטה של פסטר. אספו את השכבה הבין-פאזית התחתונה המכילה את ה-PBMC, והעבירו שכבה זו לצינור חדש של 50 מיליליטר.
השהה את התאים עד 50 מיליליטר עם PBS סטרילי, ושטוף את מדיום שיפוע הצפיפות השיורית על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם בלימה מלאה. כדי להסיר שאריות טסיות, חזור על תהליך הצנטריפוגה כמתואר בכתב היד, השהה מחדש את ה- PBMCs המבודדים והמטוהרים ב- 20 מיליליטר PBS, וספור אותם באמצעות המציטומטר בשיטה הסטנדרטית. כדי להעשיר CD14+מונוציטים, העבירו 1 x 10 למרכזייה השביעית לתוך צינור פוליסטירן עגול מתאים, ושפכו את התאים ב 300 x גרם במשך חמש דקות.
לאחר השלכת הסופרנאטנט והשעיית כדורית התא במאגר הפרדת תאים, יש לדגור על התאים עם קוקטייל נוגדנים של 10 מיקרוליטר לכל 100 מיקרוליטר עם המכסה למשך 10 דקות. בתום הדגירה מוסיפים 10 מיקרוליטר של ננו-חלקיק מגנטי לחרוזים לכל 100 מיקרוליטר, ודגרים במשך שלוש דקות עם המכסה. הגדל את עוצמת הקול ל- 2.5 מיליליטר באמצעות מאגר הפרדת התא.
הכניסו את הצינור למגנט, ודגרו במשך שלוש דקות כשהמכסה כבוי. כעת, השליכו את אוכלוסיית התאים השליליים בתנועה רציפה אחת על ידי היפוך כאשר הצינור עדיין נמצא במגנט. הסר את הצינור מהמגנט, שטוף את המונוציטים המועשרים CD14+ המחוברים לחרוזים המגנטיים על ידי השעייתם מחדש ב -2.5 מיליליטר של חיץ תרחיף התא, והחזיר את הצינור למגנט.
ספור את התאים המבודדים כפי שהודגם קודם לכן. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300 x גרם במשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את התאים במיליון תאים למיליליטר בתווך אלפא חיוני מינימלי מלא עם 10% FBS.
כדי להבדיל את האוסטאוקלסט, יש להוסיף M-CSF בריכוז סופי של 25 ננוגרם למיליליטר לתרחיף התא, ולערבב על ידי פיפטציה יסודית כדי ליצור הומוגניות בתרחיף התא. צלחת 100 מיקרוליטר של ההשעיה לכל באר בצלחת שטוחה 96 באר. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים לכל באר סביב התאים המצופים כדי למנוע אידוי בינוני והשפעות קצה במערכת התרבית.
לדגור על התאים במשך לילה במשך כ 18 עד 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. הכינו מדיה טרייה בתוספת ליגנד M-CSF ו-RANK. לאחר הדגירה, יש להסיר בזהירות מחצית מהמדיום על ידי שאיפה באמצעות פיפטה P200, ולהחליף אותו בתווך שלם טרי וחם בתוספת ליגנד M-CSF ו-RANK בריכוז סופי של 25 ננוגרם למיליליטר.
התמינו את התאים לאוסטאוקלסטים במשך שבעה עד 14 ימים עם החלפה מלאה של מדיום כל שלושה ימים. לאחר הסרת המדיום, לתקן את osteoclasts דבק מובחן עם 100 מיקרוליטר לכל באר של פתרון קיבוע מוכן, לדגור במשך דקה אחת. אין לגעת בתחתית הבארות כדי למנוע שריטה של התאים הדבקים.
לאחר ששטפו את הבארות שלוש פעמים ב-300 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים, ייבשו את הצלחות והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה טרייה לכל באר. דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות. לאחר הדגירה מסירים את תמיסת הצביעה בהיפוך ושוטפים את הצלחת שלוש פעמים במים מזוקקים של 300 מיקרוליטר לבאר.
הסירו את עודפי המים על ידי הקשה על הצלחות על מגבות נייר, והשאירו את הצלחות פתוחות ומוגנות מפני אור לייבוש באוויר למשך הלילה. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם אפשרות אריח, צלם תמונות במהירות של 10x או 20x כדי ללכוד את כל משטח הבאר. ספור ידנית את האוסטאוקלסטים המזוהים כתאים מוכתמים TRAP+סגולים עם יותר משלושה גרעינים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עם תוסף מונה תאים.
צלחת 100 מיקרוליטר של CD14 + מונוציטים מבודדים לכל באר בשקופית תא 18 באר בצפיפות תאים של 1 x 10 לתאים החמישיים לכל באר. להבדיל בין האוסטאוקלסטים בנוכחות ליגנד M-CSF ו-RANK כפי שהודגם קודם לכן עם שינוי מוחלט של מדיום כל שלושה ימים. בנקודת הסיום, הסירו בעדינות את המדיום ושטפו כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS שחומם מראש ב-pH 7.4.
אל תתנו לבארות להתייבש בין השלבים. תקן את הדגימה עם 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת פורמלדהיד 4% ב- PBS, ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית עם ניעור עדין. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר לכל באר של PBS.
חדרו את התאים עם 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת טריטון x-100 0.1% מדוללת ב-PBS, ודגרו במשך 10 דקות כפי שהוצג קודם לכן. יש לשטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר לבאר של PBS. כדי לחסום קשירה לא ספציפית ולהגדיל את האות, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המיוצרת עם אלבומין בסרום בקר 2% ותמיסת PBS.
יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי עם ניעור עדין. לאחר הסרת תמיסת החסימה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת פלואידין מצומדת פלואורסצנטית מדוללת בתמיסת 2% BSA/PBS לכל באר. יש לשטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר לבאר של PBS.
מכתימים את הגרעינים ב-100 מיקרוליטר לבאר של תמיסה של PBS המכילה 300 ננו-טוחן DAPI. לאחר 10 עד 15 דקות, הסר את תמיסת DAPI והחלף אותה ב- PBS של 100 מיקרוליטר לכל באר. דמיינו את הצביעה באמצעות מיקרוסקופים אימונופלואורסצנטיים או קונפוקליים מתאימים פי ארבעה עד 40.
האוסטאוקלסטים הבוגרים מוגדרים כ-TRAP+תאי נוקלאט מרובים. התוספת של ליגנד RANK יצרה מספר גדל והולך של אוסטאוקלסטים גדולים מסוג TRAP+multi-nucleated באופן תלוי מינון. הקינטיקה של התמיינות אוסטאוקלסטים ממונוציטים נחקרה במשך תקופת תרבית של יומיים עד 14 ימים.
אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים נראו מהיום החמישי ואילך, והתמיינות אופטימלית הושגה ביום השביעי. ההבחנה של אוסטאוקלסטים על משטחים מינרליים מאפשרת להעריך את פעילות הספיגה שלהם על ידי ניתוח היווצרות חורים עגולים, או בורות ספיגה. אחוז הספיגה עולה באופן משמעותי בנוכחות ליגנד M-CSF ו- RANK בהשוואה ל- M-CSF בלבד.
יתר על כן, טיפול במינון רוטנון תלוי עיכב את ספיגת המשטח המינרלי בהשוואה לבאר הבקרה שלא טופלה. עיכוב תלוי רוטנון של ספיגת אוסטאוקלסטים היה קשור לעיכוב ייצור ATP. הפיצול של טבעת האקטין הנגזרת מליגנד RANK של OCS בוגר נצפה בנוכחות רוטנון.
חשוב לוודא כי מונוציטים מועשר אינם מכילים טסיות, כי התאים מצופים בצפיפות הנכונה, וכי הבארות שמסביב מלאים במים כדי למנוע את אפקט הקצה. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי לחקור באופן מכניסטי כיצד נוצרים אוסטאוקלסטים, ומה משפיע על תפקודם הן במדע בסיסי והן במדע תרגומי. למשל, על ידי שימוש בתרכובות או חלבונים שיכולים לווסת את התהליכים האלה.
