0. Protokolümüz, farklılaşma süreçlerinin ve işlevlerinin altında yatan mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek osteoklast in vitro üretmek için optimize edilmiş ve tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, sadece bir hafta içinde çok sayıda fonksiyonel olarak aktif osteoklast üretme yeteneğidir. Saflaştırılmış monositler kullanılarak ve zamanında sitokinler eklenerek yüksek farklılaşma verimi elde edilir.
Osteoklastlar, artritin her formunda kemik yıkımından sorumludur ve bu yöntem, farklılaşmalarını ve / veya işlevlerini modüle edebilen yeni terapötik bileşikleri taramak için araçlar sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Patricia Riedlova olacaktır. Başlamak için, kanı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktararak PBMC'leri izole edin.
Taze kan için eşit hacimde steril PBS ile veya lökosit konileri ve kabarık katlar için 1: 3 oranında seyreltin. Kanı ters çevirerek yavaşça karıştırın. Üç mililitre yoğunluk gradyan ortamı içeren 15 mililitrelik tüpler hazırlayın ve karıştırmayı önleyerek yoğunluk gradyanı ortamının üstüne yavaşça sekiz ila 10 mililitre seyreltilmiş kan tabakası koyun.
Tüpü 400 x g'de oda sıcaklığında 30 dakika boyunca frensiz olarak santrifüj edin. Ardından üst katmanı bir Pasteur pipet ile dikkatlice atın. PBMC'leri içeren alt fazlar arası tabakayı toplayın ve bu katmanı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.
Steril PBS ile 50 mililitreye kadar olan hücreleri askıya alın ve artık yoğunluk gradyan ortamını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak tam frenle yıkayın. Artık trombositleri çıkarmak için, makalede açıklandığı gibi santrifüjleme işlemini tekrarlayın, izole edilmiş ve saflaştırılmış PBMC'leri 20 mililitre PBS'de yeniden askıya alın ve standart yöntemi izleyerek bir hemasitometre kullanarak sayın. CD14 + monositleri zenginleştirmek için, 1 x 10'u yedinci PBMC'lere uygun bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'de pelet edin.
Süpernatantı attıktan ve hücre peletini hücre ayırma tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca kapak açıkken 100 mikrolitre başına 10 mikrolitre antikor kokteyli ile inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, 100 mikrolitre başına 10 mikrolitre manyetik nanopartikül boncuğu ekleyin ve kapak açıkken üç dakika boyunca inkübe edin. Hücre ayırma arabelleği ile ses seviyesini 2,5 mililitreye kadar doldurun.
Tüpü bir mıknatısa yerleştirin ve kapağı kapalıyken üç dakika boyunca inkübe edin. Şimdi, tüp hala mıknatısın içindeyken negatif hücre popülasyonunu ters çevirerek sürekli bir hareketle atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın, manyetik boncuklara tutturulmuş zenginleştirilmiş CD14 + monositleri, hücre süspansiyon tamponunun 2,5 mililitresinde yeniden askıya alarak yıkayın ve tüpü mıknatısa geri yerleştirin.
İzole edilmiş hücreleri daha önce gösterildiği gibi sayın. Toplanan hücreleri beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri% 10 FBS ile tam alfa minimum esansiyel ortamda mililitre başına 1 milyon hücrede yeniden askıya alın.
Osteoklastı ayırt etmek için, hücre süspansiyonuna mililitre başına 25 nanogramlık son konsantrasyonda M-CSF ekleyin ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için pipetleyerek iyice karıştırın. Düz tabanlı 96 delikli bir plakada kuyu başına süspansiyonun 100 mikrolitresini plakalayın. Daha sonra, kültür sisteminde orta buharlaşmayı ve kenar etkilerini önlemek için kaplanmış hücrelerin etrafına kuyu başına 200 mikrolitre steril damıtılmış su ekleyin.
Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede yaklaşık 18 ila 20 saat boyunca inkübe edin. M-CSF ve RANK ligand ile desteklenmiş taze medya hazırlayın. İnkübasyondan sonra, bir P200 pipet kullanarak ortamın yarısını aspirasyonla dikkatlice çıkarın ve mililitre başına 25 nanogramlık son konsantrasyonda M-CSF ve RANK ligand ile desteklenmiş taze, ılık tam ortam ile değiştirin.
Hücreleri yedi ila 14 gün boyunca osteoklastlara ayırın ve her üç günde bir ortamın tamamen değiştirilmesiyle değiştirin. Ortamı çıkardıktan sonra, farklılaşmış yapışkan osteoklastları, hazırlanan fiksatif çözeltinin kuyucuk başına 100 mikrolitre ile sabitleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Yapışkan hücrelerin çizilmesini önlemek için kuyucukların dibine dokunmayın.
Kuyucuklar 300 mikrolitre steril damıtılmış su ile üç kez yıkandıktan sonra, plakaları kurutun ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre taze hazırlanmış boyama çözeltisi ekleyin. Plakayı karanlıkta 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boyama çözeltisini ters çevirerek çıkarın ve plakayı üç kez damıtılmış su kuyusu başına 300 mikrolitre ile yıkayın.
Tabakları kağıt havluların üzerine dokundurarak fazla suyu çıkarın ve tabakları açık bırakın ve gece boyunca ışıktan hava kurumasına kadar koruyun. Karo seçeneğine sahip bir parlak alan mikroskobu kullanarak, tüm kuyu yüzeyini yakalamak için 10x veya 20x'te görüntü çekin. Bir hücre sayacı eklentisine sahip bir görüntü analiz yazılımı kullanarak üçten fazla çekirdeğe sahip TRAP + mor boyalı hücreler olarak tanımlanan osteoklastları manuel olarak sayın.
İzole CD14 + monositlerin 100 mikrolitresini 18 delikli bir oda slaytında, 1 x 10'luk bir hücre yoğunluğunda, kuyu başına beşinci hücrelere kadar plakalayın. Osteoklastları, daha önce gösterildiği gibi M-CSF ve RANK ligand varlığında her üç günde bir tam bir ortam değişikliği ile ayırt edin. Bitiş noktasında, ortamı yavaşça çıkarın ve pH 7.4'te 200 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS ile her bir kuyuyu iki kez yıkayın.
Kuyucukların adımlar arasında kurumasına izin vermeyin. Numuneyi PBS'de kuyucuk başına 100 mikrolitre% 4 formaldehit çözeltisi ile sabitleyin ve hafifçe çalkalayarak yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri iki kez PBS kuyusu başına 200 mikrolitre ile yıkayın.
PBS'de seyreltilmiş %0.1 Triton x-100 çözeltisinin kuyu başına 100 mikrolitre ile hücreleri geçirgenleştirin ve daha önce gösterildiği gibi 10 dakika inkübe edin. Kuyucuk başına 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın. Spesifik olmayan bağlanmayı bloke etmek ve sinyali arttırmak için,% 2 sığır serum albümini ve PBS çözeltisi ile yapılan 100 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin.
Hafifçe çalkalayarak yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, her bir kuyucuğa% 2 BSA / PBS çözeltisi içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre floresan konjuge faloidin çözeltisi ekleyin. Kuyucuk başına 200 mikrolitre PBS ile iki kez yıkayın.
Çekirdekleri, 300 nanomolar DAPI içeren bir PBS çözeltisinin kuyucuk başına 100 mikrolitre ile lekeleyin. 10 ila 15 dakika sonra, DAPI çözeltisini çıkarın ve kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile değiştirin. Boyamayı dört ila 40x'te uygun immünofloresan veya konfokal mikroskoplar kullanarak görselleştirin.
Matür osteoklastlar TRAP+multipl nükleat hücreleri olarak tanımlanır. RANK ligandının eklenmesi, doza bağımlı bir şekilde artan sayıda büyük TRAP + çok çekirdekli osteoklastlar üretti. Monositlerden osteoklast farklılaşmasının kinetiği iki ila 14 günlük bir kültür periyodu boyunca araştırıldı.
Çok çekirdekli osteoklastlar beşinci günden itibaren görülebildi ve yedinci günde optimal farklılaşmaya ulaşıldı. Osteoklastların mineralize yüzeylere farklılaşması, yuvarlak deliklerin veya rezorpsiyon çukurlarının oluşumunu analiz ederek rezorpsiyon aktivitelerini değerlendirmeyi sağlar. Rezorpsiyon yüzdesi, M-CSF ve RANK ligand varlığında tek başına M-CSF ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artar.
Ayrıca, rotenon dozuna bağlı olarak tedavi, tedavi edilmemiş kontrol kuyusuna kıyasla mineralize yüzeyin emilimini inhibe etmiştir. Osteoklast rezorpsiyonunun rotenona bağımlı inhibisyonu, ATP üretiminin inhibisyonu ile ilişkiliydi. Olgun OCS'nin RANK ligand kaynaklı aktin halkasının parçalanması rotenon varlığında gözlendi.
Zenginleştirilmiş monositlerin trombosit içermediğinden, hücrelerin doğru yoğunlukta kaplandığından ve kenar etkisini önlemek için çevredeki kuyucukların suyla doldurulduğundan emin olmak önemlidir. Bu protokol, osteoklastların nasıl oluştuğunu ve hem temel hem de translasyonel bilimde işlevlerini neyin etkilediğini mekanik olarak sorgulamak için özellikle yararlıdır. Örneğin, bu süreçleri modüle edebilen bileşikler veya proteinler kullanarak.
