פרוטוקול ELISA שונה זה מאפשר טיהור וכימות מדויק של CGRP בפלזמה אנושית. הוא עבר ניסויי תיקוף נחוצים ויכול לשמש לסטנדרטיזציה של מתודולוגיות כימות עתידיות. פרוטוקול זה מציע את היתרונות של הכללת עיבוד דגימה לפני פירוק פרוטאז משמעותי, טיהור באמצעות מיצוי פאזה מוצקה, והגבלה של קשירה לא ספציפית על ידי יישום של חיץ חוסם ללוחות microtiter.
CGRP ממלא תפקיד ענישה בפתופיזיולוגיה של מיגרנה ואולי מועמד למעמד של סמן ביולוגי. הוא היה מעורב גם בתהליכי מחלה קרדיולוגיים, דרמטולוגיים, ויראליים ואפילו COVID-19. כדי להתחיל, לאסוף 5 מיליליטר של דם שלם מן הווריד antecubital באמצעות שיטות venipuncture סטנדרטי לתוך 6 מיליליטר vacutainer EDTA צינור.
כדי לחסום את הליזה של פפטיד המטרה, להוסיף 0.5 מיליליטר של מעכב פרוטאז סרין תחרותי aprotinin. הפכו את הצינור 10 פעמים ואחסנו אותו על קרח עד לשלב הבא. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 600 4g במשך ארבע דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
ומעבירים את שבר הפלזמה לבקבוקון קריו סטרילי תחתון עגול של 2 מיליליטר. יש לאחסן מיד את בקבוקון הקריו בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. לחילוץ דגימת הפלזמה, הניחו מחסנית חילוץ בתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר.
העבר 5 מיליליטר של 100% מתנול, ולאחר מכן 10 מיליליטר של מים טהורים במיוחד דרך המחסנית כדי להפעיל אותו. הנוזל ייאסף בצינור כשהוא עובר דרך המחסנית על ידי זרימה מונעת כבידה. יש להשליך את עודפי הנוזלים שהצטברו כדי למנוע מהם לבלוע את המחסנית ולוודא שהיא לא תתייבש במהלך הניסוי.
לדלל 250 מיקרוליטר של פלזמה ב 750 מיקרוליטר של 4% חומצה אצטית, ולאט לאט להעביר אותו דרך המחסנית. לאחר מכן לשטוף את המחסנית עם 10 מיליליטר של חומצה אצטית. לאחר הסרת הנוזל העודף, העבר את המחסנית לצינור צנטריפוגה חרוטי חדש של 15 מיליליטר.
הכינו 3 מיליליטר של תמיסת חומצה אצטית מתנול כדי להאיר את הפפטיד הקשור לגן קלציטונין או CGRP. העבירו מיליליטר אחד ממנו דרך המחסנית והמתינו 25 דקות בין כל הדבקה. לאחר ההדבקה האחרונה, הצינור מכיל 3 מיליליטר של אלואנט כולל.
מעבירים מיליליטר אחד של הלואנט לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר, ומסובבים אותו במיני צנטריפוגה למשך שנייה אחת כדי להרגיע את הלואנט. לאחר מכן יבש את הדגימה בצנטריפוגת ואקום ב 1, 400 סל"ד ו 4 מעלות צלזיוס. מיד לפני הבדיקה, לשחזר את הדגימה מיובשת עם אנזים מופשר immunoassay או מאגר EIA.
לחסימת צלחות, הוסיפו 250 מיקרוליטר של חיץ חוסם ג'לטין דגים TBS לכל באר. מניחים יריעת שער מעל הצלחת ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את יריעת השער ורוקן את הצלחת על ידי היפוכה.
לאחר מכן כתם את הצלחת על מגבת נייר כדי להשליך כל נוזל עקבות ולייבש אותו במכסה מנוע זרימה למינרית במשך 10 דקות. לאחר שהצלחת יבשה באופן ניכר לעין, הניחו אותה בשקיק רדיד אלומיניום אטום עם שקית לייבוש ג'ל סיליקה. אחסנו אותו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
לפני ביצוע הבדיקה, להפשיר את כל הדגימות ריאגנטים מוכנים בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף את הבארות של צלחת הבלוקים, להוסיף 300 מיקרוליטר של חיץ לשטוף ולתת לו לשבת במשך 30 שניות. לאחר מכן השליכו את מאגר הכביסה וחזרו על השטיפה חמש פעמים.
לאחר השטיפה האחרונה, כתם את הצלחת כפי שהודגם קודם. לאחר מכן, חלק 100 מיקרוליטר של חיץ EIA לשתי בארות כריכה לא ספציפיות או NSB. הוסף 100 מיקרוליטר של תקני CGRP, ולאחר מכן מדגם משוחזר ובקרת איכות לשכפל לתוך בארות מתאימות.
הוסף 100 מיקרוליטר של נותב CGRP לכל באר, למעט הבארות הריקות. לבסוף, אטמו את הצלחת באמצעות יריעת כיסוי שקופה, כדי להבטיח שהדגימות והריאגנטים לא יתאדו, ודגרו על הצלחת במשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כאשר תקופת הדגירה מסתיימת, הכינו את המגיב של אלמן בהתאם להוראות היצרן.
לאחר פירוק הצלחת, שטפו היטב כל אחת מהן שלוש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר השטיפה האחרונה, נערו את הצלחת במהירות 120 סל"ד למשך שתי דקות. שוב, שטפו את הצלחת שלוש פעמים וייבשו אותה.
הקש על הצלחת ההפוכה עד שהנוזל יוסר באופן גלוי מהבארות. לאחר מכן הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב אלמן לכל באר למעט בארות ריקות. לאחר כיסוי הצלחת, עטפו אותה ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור ודגרו עליה בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה לפני רישום הספיגה.
המחקר הנוכחי הראה כי בתוספת שלב החסימה, שיעורי ההתאוששות בכל דגימת ספייק CGRP היו בטווח המקובל. עם זאת, כאשר שלב החסימה לא נכלל, הקשירה הלא ספציפית הביאה לשיעורי החלמה העולים על הגבול העליון של 125%חשוב להוסיף אפרוטינין כדי להחזיק דגימות דם זמן קצר לאחר האיסוף כדי להגביל את השפלת CGRP. בנוסף, יש להוסיף את מאגר החסימה ללוחית המיקרוטיטר לפני ELISA כדי להפחית עוד יותר קשירה לא ספציפית.
לכן ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לחקור את המועמדות של CGRP כסמן ביולוגי למיגרנה וסטיבולרית על ידי כימות רמות CGRP בחולי פלזמה עם מיגרנה ושיווי משקל לעומת קבוצת ביקורת.
