עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82173991), ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2022YFS0442).

ראו טבלה 1 למידע על החומרים הרפואיים של Pheretima, Periplaneta americana ו-Hirudo. הם זוהו על ידי פרופ' שו רונצ'ון, מאוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, כגופותיהם המיובשות של Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. ו-Whitmania pigra Whitman.
1. מיצוי דגימות
<ol><li>מרסקים את Pheretima, Periplaneta americana ו-Hirudo בעזרת מטחנת צמחים (ראו טבלת חומרים), מנפים את האבקה הרפואית דרך מס' 2 (צמצם מסננת: 0.8 מ"מ) ומס' 4 (צמצם מסננת: 0.25 מ"מ) מסננות תרופות סטנדרטיות, ואוספים את האבקה בין שתי המסננות כדי לקבל את אבקת הדגימה הנדרשת. הערה: הפרטימה רכה לאחר הריסוק, ולכן אין צורך לנפות את האבקה שלה.</li>
	<li>יש ליטול גרם אחד של אבקה (מדויק עד 0.001 גרם) בצינור צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 50 מ"ל, להוסיף 20 מ"ל של תמיסת חומצה טריכלורואצטית (TCA) 5% (ראו טבלת חומרים) וליצור הומוגניזציה במהירות של 1,000 סל"ד-1 למשך דקה אחת עם הומוגנייזר פיזור במהירות גבוהה.</li>
	<li>לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה בגודל 1,717 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים מעט כותנה סופגת במשפך הזכוכית, ומסננים את הסופרנאטנט לצלוחית נפחית של 50 מ"ל.</li>
	<li>חזור על תהליך המיצוי לעיל פעמיים עם 15 מ"ל ו 10 מ"ל של תמיסת TCA 5%. שלב את התסנין ודלל אותו ל 50 מ"ל עם תמיסת TCA 5%.</li>
</ol>2. הכנת מגיב
<ol><li>הכינו תמיסת נתרן הידרוקסיד 20%: שקלו 20 גרם נתרן הידרוקסידי והשתמשו במים נטולי יונים, כדי לקבע את הנפח בצלוחית נפחית של 100 מ"ל.</li>
	<li>הכינו תמיסת TCA 5%: שקלו 25 גרם TCA והשתמשו במים נטולי יונים, כדי לקבע את הנפח בצלוחית נפחית של 500 מ"ל.</li>
</ol>3. הכנת פתרון מלאי סטנדרטי TMA
<ol><li>הכינו תמיסת מלאי סטנדרטית של TMA: שקלו 0.0162 גרם של דגימה סטנדרטית TMA הידרוכלוריד, המסו אותה בתמיסת TCA 5% וקיבעו את הנפח ל-100 מ"ל, שווה לריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת מלאי סטנדרטית TMA. אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הכן פתרון שימוש סטנדרטי של TMA: קח נפח מסוים של תמיסת מלאי סטנדרטית TMA ודלל אותו צעד אחר צעד עם תמיסת TCA 5% לריכוזים של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 2 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה סטנדרטית TMA.</li>
</ol>4. עיבוד headspace לדוגמה
<ol><li>שקלו במדויק 2 מ"ל תמיסת נתרן הידרוקסידי ו-0.5 גרם פרפין מוצק (נקודת התכה: 58-60 מעלות צלזיוס) בבקבוקון מרווח של 20 מ"ל (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>מכניסים את בקבוקון הראש לתנור ל-70 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות. הפרפין המוצק נמס לחלוטין.</li>
	<li>הוציאו אותו, ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר, כך שהפרפין יתמצק. הפרפין המוצק יאטום נתרן הידרוקסידי.</li>
	<li>קח 2 מ"ל מכל תמיסת מיצוי דגימה והנח אותה על גבי שכבת הפרפין, לחץ על המכסה ואטם.</li>
	<li>הניחו את בקבוקון מרווח הראש האטום על המכשיר (ראו טבלת חומרים) לצורך מדידה.</li>
</ol>5. הגדרת תנאי ניתוח HS-GC-MS/MS
<ol><li>ראה טבלה 2 עבור תנאי headspace ותנאי GC-MS.</li>
	<li>ראו טבלה 3 למידע על יונים.</li>
</ol>6. ציור עקומה סטנדרטי
<ol><li>עיין בעיבוד headspace לדוגמה בשלבים 4.1-4.3 כדי להכין את בקבוקון headspace המכיל שכבת איטום lye ופרפין.</li>
	<li>יש לשאוף 2 מ"ל של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 2 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה סטנדרטית TMA בנפח 20 מ"ל, לאטום את המכסה ולמדוד במכשיר.</li>
</ol>7. בדיקת דיוק
<ol><li>עיין בעיבוד headspace לדוגמה בשלבים 4.1-4.3 כדי להכין את בקבוקון headspace המכיל lye ואת שכבת איטום הפרפין.</li>
	<li>יש לשאוף 2 מ"ל של תמיסה סטנדרטית TMA של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל לתוך בקבוקון מרווח ראש של 20 מ"ל ולאטום את המכסה. לבצע שש בדיקות מקבילות במכונה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>8. ניסוי קצב התאוששות
<ol><li>קח קבוצה של Pheretima, Periplaneta Americana, ו Hirudo (S02, S05, S07; טבלה 1) כתרופות המייצגות לניסוי שיעור ההחלמה.</li>
	<li>קח כמה קבוצות של אבקה לדוגמה (S02, S05, S07) ואופים אותם בתנור ב 50 ° C במשך 72 שעות עד לא מזוהה TMA.</li>
	<li>עיין בשיטת הכנת הדגימה בסעיפים 4-6 כדי לזהות את תכולת TMA באבקת רפואה אפויה.</li>
	<li>קח 1 גרם של אבקה אפויה (מדויק ל 0.001 גרם), לשים אותו לתוך צינור צנטריפוגת פלסטיק 50 מ"ל, ולהוסיף 50 μL של תמיסה סטנדרטית TMA. הערה: הריכוז של תמיסה סטנדרטית TMA הוא 100 מיקרוגרם/מ"ל, 1000 מיקרוגרם/מ"ל ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
	<li>הוסף 20 מ"ל של תמיסת TCA 5% והומוגניזציה ב 1000 סל"ד-1 למשך דקה אחת.</li>
	<li>לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה ב 1717 x גרם במשך 5 דקות, מוסיפים מעט כותנה סופגת במשפך הזכוכית ומסננים את supernatant לתוך בקבוק נפח 50 מ"ל.</li>
	<li>חזור על תהליך המיצוי לעיל פעמיים עם 15 מ"ל ו 10 מ"ל של תמיסת TCA 5%; שלב את התסנין ודלל אותו ל 50 מ"ל עם תמיסת TCA 5%.</li>
</ol>9. קביעת גבולות הזיהוי (LOD) והכימות (LOQ)
<ol><li>קבע את LOD לפי הריכוז המתאים כאשר יחס אות לרעש (S/N) = 3.</li>
	<li>קבע את LOQ לפי הריכוז המתאים כאשר S/N = 10.</li>
</ol>10. קביעת תוכן TMA לדוגמה
<ol><li>קח בערך 1 גרם של אבקה דקה של Pheretima, Periplaneta americana, ו Hirudo , בהתאמה, לחלץ את הדגימה על פי השיטה לעיל, ולקבוע אותו על המכונה.</li>
</ol>

זיהוי טרימתילאמין ברפואה מן החי על ידי Headspace GC-MS

<ol>
	<li>Fan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+basis+of+stench+of+animal+medicine:+a+review.">Material basis of stench of animal medicine: a review.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).</li><li>Deng, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+on+formation+and+taste-masking+technology+of+stench+of+animal+medicines.">Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines.</a> China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).</li><li>Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+populations+and+the+volatilome+associated+to+meat+spoilage.">Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage.</a> Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).</li><li>Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contaminants+of+poultry+meat:+sources,+species,+and+dynamics.">Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics.</a> Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).</li><li>Bali&#241;o-Zuazo, L., Barranco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+liquid+chromatography-mass+spectrometric+method+for+the+simultaneous+determination+of+trimethylamine,+dimethylamine+and+methylamine+in+fishery+products.">A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products.</a> Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-efficient+trimethylamine+gas+sensor+based+on+Au+nanoparticles+sensitized+WO3+nanosheets+for+rapid+assessment+of+seafood+freshness.">Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness.</a> Food Chemistry. 392, 133318 (2022).</li><li>Bota, G. M., Harrington, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+trimethylamine+in+meat+food+products+using+ion+mobility+spectrometry.">Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry.</a> Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).</li><li>Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivatization-free+determination+of+short-chain+volatile+amines+in+human+plasma+and+urine+by+headspace+gas+chromatography-mass+spectrometry.">Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).</li><li>Mitsubayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethylamine+biosensor+with+flavin-containing+monooxygenase+type+3+(FMO3)+for+fish-freshness+analysis.">Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis.</a> Sensors &amp; Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).</li><li>National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).</li><li>Liu, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+material+basis+and+processing+principle+of+fishy+smell+of+Pheretima+aspergillum+by+electronic+nose+and+HS-GC-MS.">Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS.</a> Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).</li><li>Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+on+changes+of+volatile+components+in+Gecko+before+and+after+processing+by+HS-SPME-GC-MS.">Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS.</a> Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).</li><li>Yoshiharu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Odor olfactory measurement. , (2004).</li><li>Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+sulfur+dioxide+residues+in+sulfur+fumigated+Chinese+herbs+with+headspace+gas+chromatography.">Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography.</a> Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תרופות מן החי מגיעות מכל הגוף, איברים או רקמות, מוצרים פיזיולוגיים או פתולוגיים, הפרשות או הפרשות, ומוצרים מעובדים של בעלי חיים. TMA הוא מקור חשוב לריח דגים בתרופות מן החי; זהו חומר בעל ריח רע טיפוסי עם סף ריח נמוך מאוד (0.000032 × 10-6 V/V) וריח דגים חזק13. כיום, שיטת HS-GC-MS הנפוצה אינה ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65291">An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry</a>. The Authors section was updated from:
Hui Ye1 
Xuemei Liu1 
Haozhou Huang2 
Lin Huang1 
Yang Bao1 
Hongyan Ma1 
Junzhi Lin3 
Xiaoming Bao4 
Dingkun Zhang1 
Runchun Xu1 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 
4Shimadzu (China) Co., Ltd
to:
Hui Ye1 
Xuemei Liu1 
JiaBao Liao2 
Haozhou Huang3 
Lin Huang1 
Yang Bao1 
Hongyan Ma1 
Junzhi Lin4 
Xiaoming Bao5 
Dingkun Zhang1 
Runchun Xu1 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd 
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine 
5Shimadzu (China) Co., Ltd

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65291">An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry</a>. The Authors section was updated.

Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

טיפול במחלות אנושיות על ידי שימוש במוצרים שמקורם בחלקי בעלי חיים ו / או תוצרי הלוואי שלהם (המכונים כאן תרופות מן החי) זוכה לתשומת לב מוגברת. הם ממלאים תפקיד חשוב בטיפול בסרטן, מחלות לב וכלי דם, שחמת הכבד, דלקת השדים ומחלות אחרות, עם יתרונות של השפעה חזקה, מינון קטן, ויעילות קלינית משמעותית וספציפית. עם זאת, תרופות שמקורן מן החי בדרך כלל יש ריח דגים בולט, אשר משפיע מאוד על ההיענות של החולים, והם שליליים במיוחד עבור ילדים 1,2. ריח הדג מגיע בעיקר מהחלבונים, חומצות האמינו, השומנים וחומרים אחרים הכלולים בתרופה, אשר מפורקים באמצעות חמצון חומצות שומן, פירוק חומצות אמינו ודרכים אחרות לייצר מגוון חומרים בעלי ריח דגים 2,3,4. ביניהם, trimethylamine (TMA) הוא גז נדיף עם ריח דגים כי קיים נרחב מזונות נרקבים או רקובים מן החי5.
עד כה, כרומטוגרפיית גז (GC), כרומטוגרפיה נוזלית (LC), כרומטוגרפיית יונים, ספקטרופוטומטריה, ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-מסה (LC-MS), ושיטות חיישנים שימשו בדרך כלל לגילוי TMA בסביבה, מזון ושתן 6,7,8,9. לאור הזיהום הנמוך של עמוד ה-GC ומערכת ההזרקה, כמו גם הרגישות הגבוהה, יכולת השחזור ומגבלת הגילוי הנמוכה (0.1-1 מ"ג/ק"ג), שיטת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז Headspace (HS-GC-MS) הועדפה לניתוח מזון וביולוגי8. נכון לעכשיו, רק סין קבעה תקן לאומי עבור TMA במזון, ו- HS-GC-MS היא השיטה הראשונה בתקן GB5009.179-201610. לכן, שיטת HS-GC-MS הנ"ל נבחרה כדי לזהות TMA ברפואה שמקורה בבעלי חיים. בשלב המוקדם, קבוצת המחקר שלנו מצאה כי תקן זיהוי HS-GC-MS עבור TMA במזון יכול לזהות את ריח הדג במספר תרופות שמקורן בבעלי חיים. בשילוב עם תוצאות המחקרים11,12, ניתן להוכיח כי TMA הוא חומר המפתח הנפוץ של ריח דגים בתרופות מן החי. עם זאת, נמצא כי יכולת השחזור של תוצאות הניסוי הייתה ירודה, והיו בעיות כגון בריחת TMA ויציבות ירודה, שלא ניתן היה לאמת על ידי המתודולוגיה. זה יכול להיות בגלל העובדה שהליי הוזרק לתוך בקבוקון הראש והתגובה החומצית-בסיסית המהירה הובילה ללחץ מוגבר בבקבוקון, וכך TMA ברח מנקבובית ההזרקה, ומנע זיהוי יציב ומדויק של TMA. לכן, מחקר זה הציע שיטה משופרת לזיהוי ספקטרומטריית מסה מרובעת של גז ראש (HS-GC-MS/MS) כדי לטפל בבעיות אלה.
הפרוטוקול משפר את הטיפול המקדים לדגימה על ידי הפרדת מגיבי בסיס חומצה בטיפול המקדים בעזרת פרפין מוצק, חומר טוב לשינוי פאזה מוצק-נוזלי. כאשר הפרפין נוזל באיטיות עם עליית הטמפרטורה של הכבשן התרמוסטטי, TMA שוחרר באיטיות גם בבקבוקון הראש האטום, ובכך נמנע מעליית הלחץ הנגרמת על ידי תגובת בסיס חומצה אלימה ומהירה והבטיח זיהוי TMA יציב ומדויק. יתר על כן, הזרקת headspace בשילוב עם מצבי ניטור תגובה מרובים (MRM) ב- GC-MS/MS דיכאו ביעילות הפרעות כימיות של מטריצה והבטיחו את אמינות התוצאות. תוצאות התיקוף המתודולוגי הוכיחו כי הלינאריות, בדיקת הדיוק וקצב ההתאוששות של שיטת הזיהוי המשופרת יכולים לעמוד בדרישות, עם יכולת שחזור טובה ורגישות גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Trading (China) Co.</td>
			<td>SSC-2-0213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chinese herbal medicine grinder</td>
			<td>Zhejiang Yongkang Xi&#39;an Hardware and Pharmaceutical Factory</td>
			<td>HX-200K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Convection oven</td>
			<td>Sanyo Electric Co., Ltd</td>
			<td>MOV-112F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapper for 20 mm Aluminum caps</td>
			<td>ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc</td>
			<td>V1750004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic balance</td>
			<td>Shimadzu Corporation Japan</td>
			<td>AUW220D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography mass spectrometry</td>
			<td>Shimadzu Corporation Japan</td>
			<td>TQ-8050 NX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headspace Vial</td>
			<td>ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc</td>
			<td>25760200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Shanghai biaomo Factory</td>
			<td>FJ200-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preassembled Cap</td>
			<td>ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc</td>
			<td>L4150050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample sieve</td>
			<td>Zhenxing Sieve Factory</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-Volatile Amine</td>
			<td>Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd</td>
			<td>227-3626-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd</td>
			<td>2022101401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid paraffin wax</td>
			<td>Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory</td>
			<td>20221112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd</td>
			<td>2022102001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethylamine hydrochloride</td>
			<td>Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>AF22022108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure water system</td>
			<td>Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd</td>
			<td>UPR-11-5T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an improved technique for trimethylamine detection in animal-derived medicine by headspace gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry

לתרופות מן החי יש מאפיינים ייחודיים והשפעות מרפא משמעותיות, אך לרובן יש ריח דגים ברור, וכתוצאה מכך היענות לקויה של חולים קליניים. טרימתילאמין (TMA) הוא אחד ממרכיבי ריח הדג העיקריים ברפואה מן החי. קשה לזהות TMA במדויק באמצעות שיטת הזיהוי הקיימת בשל הלחץ המוגבר בבקבוקון הראש הנגרם על ידי התגובה החומצית-בסיסית המהירה לאחר הוספת lye, הגורמת ל-TMA לברוח מבקבוקון headspace, מה שמעכב את התקדמות המחקר של ריח הדג של תרופות שמקורן בבעלי חיים. במחקר זה הצענו שיטת זיהוי מבוקרת שהציגה שכבת פרפין כשכבת בידוד בין חומצה לליי. קצב ייצור TMA יכול להיות נשלט ביעילות על ידי הנזלה איטית של שכבת הפרפין באמצעות חימום תנור תרמוסטטי. שיטה זו הראתה ליניאריות משביעת רצון, ניסויים מדויקים והתאוששויות עם יכולת שחזור טובה ורגישות גבוהה. היא סיפקה תמיכה טכנית לנטרול ריחות של תרופות שמקורן בבעלי חיים.

Treating human diseases by utilizing products derived from animal parts and/or their by-products (referred to here as animal-derived medicines) is receiving increased attention. They play an important role in treating cancer, cardiovascular disease, liver cirrhosis, mastitis, and other diseases, with the advantages of a strong effect, small dosage, and significant and specific clinical efficacy. However, animal-derived medicines generally have a prominent fishy odor, which greatly affects patients&#39; compliance, and are especially unfavorable for children1,2. The fishy odor mainly comes from the proteins, amino acids, fats, and other substances contained in the medicine, which are decomposed through fatty acid oxidation, amino acid degradation, and other ways to produce a variety of substances with a fishy odor2,3,4. Among them, trimethylamine (TMA) is a volatile gas with a fishy odor that widely exists in rotting or rotten animal-derived foods5.
Until now, gas chromatography (GC), liquid chromatography (LC), ion chromatography, spectrophotometry, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), and sensor methods have commonly been used to detect TMA in the environment, food, and urine6,7,8,9. In view of the low contamination of the GC column and injection system, as well as the high sensitivity, reproducibility, and low detection limit (0.1-1 mg/kg), the headspace gas chromatography-mass spectrometry (HS-GC-MS) method was preferred for food and biological analysis8. At present, only China has established a national standard for TMA in food, and HS-GC-MS is the first method in the GB5009.179-2016 standard10. Therefore, the above HS-GC-MS method was selected to detect TMA in animal-derived medicine. In the early stage, our research group found that the HS-GC-MS detection standard for TMA in food could detect the fishy odor in several animal-derived medicines. Combined with the results of the studies11,12, it could be proved that TMA is the common key substance of fishy odor in animal-derived medicines. However, it was found that the reproducibility of the experimental results was poor, and there were problems such as TMA escape and poor stability, which could not be verified by the methodology. This could be due to the fact that the lye was injected into the headspace vial and the rapid acid-base reaction led to increased pressure in the vial, thus TMA escaped from the injection pore, preventing the stable and accurate detection of TMA. Therefore, this study proposed an improved headspace gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (HS-GC-MS/MS) detection method to address these problems.
The protocol improves the sample pretreatment by separating the acid-base reactants in the pretreatment with the help of solid paraffin, a good solid-liquid phase change material. As the paraffin slowly liquefied with the temperature rise of the thermostatic furnace, TMA was also slowly released in the sealed headspace vial, avoiding the pressure increase caused by the violent and rapid acid-base reaction and ensuring stable and accurate TMA detection. Further, the headspace injection combined with multiple reaction monitoring (MRM) modes) in GC-MS/MS effectively suppressed matrix chemical interference and ensured the reliability of the results. The results of the methodological validation proved that the linearity, precision test, and recovery rate of the improved detection method could meet the requirements, with good reproducibility and high sensitivity.

מחבר Spotlight: טכניקה משופרת לזיהוי טרימתילאמין ברפואה שמקורה בבעלי חיים על ידי Headspace גז כרומטוגרפיה-טנדם Quadrupole Mass Spectrometry  

טכניקה משופרת לזיהוי טרימתילאמין ברפואה מן החי על ידי Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

The scope of our research is a material basis in the variation of fish odor in animal medicine. This protocol provides a simple pretreatment method and accurate detection of trimethylamine in animal medicines. The simple pretreatment methods and the programmed parameters of HS-GC mass/mass of this protocol, need to be further optimized, and we still have a lot of work to do.Our protocol adopts the multi-direction monitoring mode of GC mass/mass, combined with a unique, simple pretreatment, which is not only the first pretreatment for trimethylamine analysis, but also the first analytical mode to be used.

דיאגרמות סכמטיות של עקרון העיבוד מראש והפעולה של פרוטוקול זה מוצגות באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. זמן השיא של TMA היה 2.3 דקות, עם צורת שיא חדה וללא הפרעות מזיהומים אחרים (איור 3). מדידת הטווח הליניארי של 0.1-10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה סטנדרטית TMA, עם ריכוז TMA כ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry at JoVE.com

כאן מתוארת שיטת ספקטרומטריית מסה מרובעת של גז ראש (HS-GC-MS/MS) המתאימה לקביעת טרימתילאמין (TMA) בתרופות שמקורן מן החי. הפרוטוקול כולל טיפול מקדים לדגימה, טיפול במרחב הראש, תנאי ניתוח, תיקוף מתודולוגי וקביעת TMA בתרופות שמקורן בבעלי חיים.

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the ...

היקף המחקר שלנו הוא בסיס מהותי לשונות ריח הדגים ברפואת בעלי חיים. פרוטוקול זה מספק שיטת קדם-טיפול פשוטה וזיהוי מדויק של טרימתילאמין בתרופות מן החי. שיטות הטיפול המקדים הפשוטות והפרמטרים המתוכנתים של מסה/מסה HS-GC של פרוטוקול זה, צריכים לעבור אופטימיזציה נוספת, ויש לנו עדיין הרבה עבודה לעשות.הפרוטוקול שלנו מאמץ את מצב הניטור הרב-כיווני של מסה/מסה של GC, בשילוב עם טיפול מקדים ייחודי ופשוט, שהוא לא רק הטיפול המקדים הראשון לניתוח טרימתילאמין, אלא גם המצב האנליטי הראשון שנעשה בו שימוש.

an-improved-technique-for-trimethylamine-detection-animal-derived

Research

JoVE Journal

Chemistry

An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

1.3K Views.  Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. היקף המחקר שלנו הוא בסיס מהותי לשונות ריח הדגים ברפואת בעלי חיים. פרוטוקול זה מספק שיטת קדם-טיפול פשוטה וזיהוי מדויק של טרימתילאמין בתרופות מן החי. שיטות הטיפול המקדים הפשוטות והפרמטרים המתוכנתים של מסה/מסה HS-GC של פרוטוקול זה, צריכים לעבור אופטימיזציה נוספת, ויש לנו עדיין ה...

Video: מחבר Spotlight: טכניקה משופרת לזיהוי טרימתילאמין ברפואה שמקורה בבעלי חיים על ידי Headspace גז כרומטוגרפיה-טנדם Quadrupole Mass Spectrometry  

Animal-derived medicines have distinctive characteristics and significant curative effects, but most of them have an obvious fishy odor, resulting in the poor compliance of clinical patients. Trimethylamine (TMA) is one of the key fishy odor components in animal-derived medicine. It is difficult to identify TMA accurately using the existing detection method due to the increased pressure in the headspace vial caused by the rapid acid-base reaction after the addition of lye, which causes TMA to escape from the headspace vial, stalling the research progress of the fishy odor of animal-derived medicine. In this study, we proposed a controlled detection method that introduced a paraffin layer as an isolation layer between acid and lye. The rate of TMA production could be effectively controlled by slowly liquefying the paraffin layer through thermostatic furnace heating. This method showed satisfactory linearity, precision experiments, and recoveries with good reproducibility and high sensitivity. It provided technical support for the deodorization of animal-derived medicine.

Here, a headspace gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry (HS-GC-MS/MS) method suitable for the determination of trimethylamine (TMA) in animal-derived medicines is described. The protocol includes sample pretreatment, headspace treatment, analysis conditions, methodological validation, and the determination of TMA in animal-derived medicines.

Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace GC-MS

To begin, crush the medicinal materials Pheretima, Periplaneta americana, and Hirudo with an herbal grinder. Sift the medicinal powder through standard drug sieves of number two and number four. Collect the powder between the two sieves to obtain the required sample powder.Take one gram of the powder in a 50 milliliter plastic centrifuge tube. Add 20 milliliters of 5%trichloroacetic acid solution and homogenize at 1, 000 RPM for one minute with a high speed dispersion homogenizer. After homogenization, centrifuge the homogenate at 1, 717 G for five minutes at room temperature and filter the supernatant through an absorbent cotton-dipped glass funnel into a 50 milliliter volumetric flask.After repeating the extraction process twice with 15 and 10 milliliters of 5%trichloroacetic acid solution, combine the filtrates and make up the volume to 50 milliliters with 5%trichloroacetic acid solution. Next, accurately add two milliliters of sodium hydroxide solution and 0.5 grams of solid paraffin in 20 milliliter headspace vials. Then place them in an oven at 70 degrees Celsius for about 30 minutes.Take the vials out and let them cool down to room temperature so that the paraffin solidifies. To process the sample headspace, add two milliliters of each sample extraction solution to the solidified paraffin containing vials. Press the cap and seal the vial.Put the sealed headspace vials on the GCMS for measurement. To obtain the standard curve, aspirate a series of two milliliters of trimethylamine standard solution on top of the solidified paraffin layer. Put the sealed headspace vials on the machine for trimethylamine measurement.To perform the precision test, aspirate two milliliters of 0.1 micrograms per milliliter trimethylamine standard solution on top of the solidified paraffin layer. Carry out six parallel tests in the machine following the manufacturer's instructions. For the recovery rate experiment, bake several batches of the sample powder in an oven until no triethylamine is detected in GCMS as demonstrated previously.Next, take each one gram of oven baked and fineable powder into separate 50 milliliter plastic centrifuge tubes. Add 50 microliters of trimethylamine standard solution to all the tubes and extract with 5%trichloroacetic acid solution as demonstrated previously. The retention time of trimethylamine was found to be 2.3 minutes with a sharp peak and no interference from other impurities.Pheretima, Periplaneta americana, and Hirudo samples subjected to spiked recovery tests by drying to reduce triethylamine in the herbs showed average recovery rates of 84.49, 94.66, and 85.67%respectively. Triethylamine was detected in nine batches of herbs with concentrations ranging from 13.23 to 271.63 milligrams per kilogram.