המחברים מודים למשתמשי טוויטר מגוונים שהעלו שאלות לגבי הפרוטוקול המוצג במאמר המתאר את טכנולוגיית VNp. איור 1A נוצר באמצעות סמלים מ-flaticon.com. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קנט ובמימון מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/T008/768/1 ו- BB/S005544/1).

עבודת החיידקים המבוצעת עוקבת אחר תקנות הכלת הבטיחות הביולוגית המקומיות, הלאומיות והבינלאומיות המתאימות לרמת הסיכון הבטיחותית הביולוגית הספציפית של כל זן.
1. בחירה של VNps שונים
<ol><li>זהה את רצפי VNp. הערה: במחקר הנוכחי זוהו שלושה רצפי VNp1 המביאים לתפוקה מקסימלית ולייצוא שלפוחית של החלבונים שנבדקו עד כה: VNp2, VNp6 ו-VNp15. כיום לא ברור מדוע גרסאות VNp מסוימות מתפקדות ביעילות רבה יותר עם חלבונים מסוימים מאשר עם אחרים; לכן, מומלץ ליצור איחוי בין חלבון חדש מעניין עם כל וריאנט VNp (כלומר, VNp2, 6 או 15). VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA AGKTKEGVL VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA AEKTKEGVM VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE פלסמידים המאפשרים ביטוי של החלבון המעניין עם איחוי מסוף אמינו VNp שונים הפכו לזמינים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>תכנן אסטרטגיית שיבוט כדי להחדיר את הגן המעניין בקצה 3' של קידוד cDNA עבור VNp באחד מהמבנים האלה, או להתאים פלסמיד קיים על ידי שילוב VNp cDNA מסונתז במעלה הזרם של קודון ATG הראשון של הגן המקודד לחלבון המעניין. השתמש בשיטות כמתואר ב- 1.</li>
	<li>עבור חלבונים רעילים, השתמש בווקטור עם מקדם ביטוי ניתן לדיכוי או פרומוטור עם רעש ביטוי מינימלי בלתי מושרה.</li>
	<li>שכפל את תג הרצף VNp במסוף האמינו-טרמינלי של חלבון ההיתוך. ודא כי תגי הזיקה, רצפי מחשוף פרוטאז וכו ', ואת החלבון של עניין ממוקמים בצד carboxyl של תג VNp. מומלץ להפריד את VNp מהפפטיד במורד הזרם עם אזור מקשר גמיש, כגון שתיים או שלוש חזרות של רצף פוליפפטיד -G-G-S-G (איור 1). הערה: השתמש פלסמידים עם בחירה אנטיביוטית שאינה מכוונת לפפטידוגליקן, אשר מחליש את פני התא ומפחית את תפוקת השלפוחית. קנמיצין וכלוראמפניקול (ראו טבלת חומרים) היו האנטיביוטיקות המועדפות ששימשו במחקר זה.</li>
</ol>2. תרבית תאים חיידקית והשראת חלבונים
הערה: זני חיידקים המשמשים בדרך כלל בפרוטוקול זה הם Escherichia coli BL21 (DE3) או W3110. תאי E. coli מגודלים בתרבית במרק ליזוגני (LB) (10 גרם/ליטר טריפטון; 10 גרם/ליטר NaCl; 5 גרם/ליטר תמצית שמרים) או בציר נהדר (שחפת) (12 גרם/ליטר טריפטון; 24 גרם/ליטר תמצית שמרים; 4 מ"ל/ליטר 10% גליצרול; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, מלחים אוטומטיים בנפרד) מדיה (ראה טבלת חומרים). תמונות לדוגמה המציגות כל שלב בהשראת החלבונים ולאחר מכן תהליך הבידוד והטיהור מוצגות באיור 2.
<ol><li>תרבית 5 מ"ל LB מתחילים מטרנספורמציות חיידקים טריים ב 37 ° C לרוויה ולהשתמש בהם כדי לחסן 25 מ"ל של שחפת בבקבוק חרוטי 500 מ"ל, כל זאת עם בחירה אנטיביוטית מתאימה.</li>
	<li>יחס שטח הפנים:נפח הוא גורם חשוב במיטוב מערכת זו. השתמש בבקבוק נפח גדול ככל האפשר (למשל, בקבוק 5 ליטר המכיל 1 ליטר תרבית; לריצות אופטימיזציה, השתמש ב -25 מ"ל של מדיה בבקבוק של 500 מ"ל).</li>
	<li>יש לדגור על תרביות הבקבוקים הגדולים יותר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם טלטול ב-200 סל"ד (≥25 מ"מ זריקת מסלול) עד לקבלת ערך צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600) של 0.8-1.0. הערה: שלפוחית היא אופטימלית כאשר תאים גדלים ב 37 ° C. עם זאת, חלק מהחלבונים הרקומביננטיים דורשים ביטוי בטמפרטורות נמוכות יותר. אם זה המקרה עבור חלבון של עניין, תג VNp6 חייב לשמש, כמו זה מאפשר ייצוא שלפוחית תפוקה גבוהה בטמפרטורות עד 25 ° C.</li>
	<li>כדי לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי ממקדם T7, הוסף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של עד 20 מיקרוגרם/מ"ל (84 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים). השראת ביטוי חלבון רקומביננטי חייבת להתרחש בשלב הרישום המאוחר (כלומר, OD600 טיפוסי של 0.8-1.0) לייצור שלפוחיות. הערה: משך תקופת האינדוקציה עשוי להשתנות בין חלבונים, כאשר חלקם מגיעים לייצור מקסימלי לאחר 4 שעות ואחרים במהלך הלילה (18 שעות). עד כה, יצוא שלפוחית מקסימלית הושג בתרבויות לילה.</li>
</ol>3. בידוד שלפוחית רקומביננטית
<ol><li>משחררים את התאים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 x גרם (4°C) למשך 20 דקות.</li>
	<li>כדי לעקר מדיה המכילה שלפוחית לאחסון לטווח ארוך, העבר את מדיית התרבית המפונה דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) סטרילי ונטול חומרי ניקוי 0.45 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים). הערה: כדי לבדוק את ההרחקה של תאים קיימא מן התסנין המכיל שלפוחית, צלחת על אגר LB לדגור לילה ב 37 ° C.</li>
	<li>כדי לרכז את השלפוחיות לנפח קטן יותר, העבירו את המצע הסטרילי המכיל שלפוחית דרך מסנן סטרילי ונטול חומרי ניקוי של אסטרי תאית מעורבת (MCE) בגודל 0.1 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>לשטוף בעדינות את הממברנה עם 0.5-1 מ"ל של PBS סטרילי באמצעות מגרד תאים או מפזר פלסטיק כדי להסיר בזהירות שלפוחיות מן הממברנה. מעבירים לצינור מיקרופוגה טרי. הערה: ניתן לאחסן בועיות מטוהרות במדיה סטרילית או במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ב-4°C. ישנן דוגמאות לחלבונים רקומביננטיים המאוחסנים בשלפוחיות אלה במשך 6 חודשים, בדרך זו, ללא אובדן בפעילות אנזימטית.</li>
</ol>4. שחרור חלבון מסיס משלפוחיות מבודדות
<ol><li>לאחר שבודדו שלפוחיות המכילות חלבון לתוך המדיה/חיץ הסטרילי, יש להעביר את קרומי השומנים השלפוחיתיים לסוניקציה באמצעות לוח זמנים מתאים למכשיר (למשל, 6x 20 שניות במחזורי הפעלה וכיבוי) וצנטריפוגה ב-39,000 x גרם (4°C) למשך 20 דקות כדי להסיר פסולת שלפוחית. הערה: ניתן להשתמש בהלם אוסמוטי או בטיפול בחומרי ניקוי כחלופה לפתיחת השלפוחיות, אך יש לקחת בחשבון את ההשפעה על פונקציונליות החלבון ו / או יישום במורד הזרם.</li>
	<li>אם היתוך VNp נשאר ציטוסולי ואינו משתחרר למדיה, בודד את החלבון באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים (למשל, השהה מחדש את כדורי התא ב- 5 מ"ל של חיץ מיצוי מתאים (20 mM tris, 500 mM NaCl), סוניקציה והסר את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה).</li>
</ol>5. קביעת ריכוז החלבונים
<ol><li>לקבוע את ריכוז החלבונים על ידי ניתוח צפיפות ג'ל של דגימות טריפליקט1. יש לפעול לצד תקני העמסת אלבומין בסרום בקר (BSA) על ג'ל אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) המוכתם בקומסי. סרוק ונתח את הג'לים באמצעות תוכנה מתאימה (לדוגמה, תמונה J; ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>6. הדמיה של היווצרות שלפוחית ובועיות מבודדות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערה: אם התאים מכילים סמני איחוי VNp או ממברנה המסומנים באופן פלואורסצנטי, ניתן להשתמש בהדמיית תאים חיים כדי לעקוב אחר היווצרות השלפוחית. לחלופין, ניתן להשתמש בצבעי שומנים פלואורסצנטיים כדי לדמיין שלפוחיות כדי לאשר ייצור וטיהור.
<ol><li>הרכבה על תאים<ol><li>השראת ביטוי היתוך VNp למשך מספר שעות לפני הרכבה על הכיסוי.</li>
		<li>שיטת פד אגרוז (איור 3A-C): מפיפטים את התאים על פד LB-agarose עגול דק (<1 מ"מ) שהותר לו להיווצר ולקבע על מגלשת זכוכית נקייה. אפשרו לתאים להתיישב ולהתאזן והניחו מכסה בגודל 50 מ"מ x 25 מ"מ על הפד והתאים. החזיקו את הכיסוי במקומו בעזרת ספייסרים וסרט הדבקה.</li>
		<li>שיטת פוליאתילניאמין (PEI) (איור 3D-F): מרחו 20 מיקרוליטר של 0.05% PEI (ב-dH2O) על כיסוי עם קצה פיפטה והשאירו למשך 3-5 דקות להיקשר לזכוכית מבלי לאפשר לה להתייבש. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תרבית תאים והשאירו למשך 5-10 דקות כדי לוודא שהחיידקים התחברו למשטח המצופה ב-PEI4. שטפו את הכיסוי עם 100 מיקרוליטר של מדיה לפני הנחתו על המגלשה והחזיקו אותו במקומו עם ספייסרים וסרט הדבקה.</li>
	</ol></li>
	<li>הרכבה שלפוחיות<ol><li>פיפטה מטהרת שלפוחיות על פד LB-agarose עגול דק (<1 מ"מ) שהותר לו להיווצר ולקבע על מגלשת זכוכית נקייה. לאחר שהנוזל התייבש, הניחו כיסוי בגודל 50 מ"מ x 25 מ"מ על הפד והשלפוחיות. החזיקו את הכיסוי במקומו בעזרת ספייסרים וסרט הדבקה.</li>
		<li>צבע השומנים הפלואורסצנטי FM4-64 מסוגל להכתים קרומים5, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לדמיין שלפוחיות. הוסף FM4-64 (ראה טבלת חומרים) לבועיות מטוהרות בריכוז סופי של 2 מיקרומטר (מציר של 2 מילימטר מומס בדימתיל סולפוקסיד [DMSO]) ותמונה לאחר דגירה של 10 דקות. זה שימושי במיוחד לזיהוי שלפוחיות המכילות מטענים שאינם מסומנים פלואורסצנטית5.</li>
		<li>שטפו את הכיסויים באותה מדיה המשמשת לתרבית התאים הנצפים. הערה: מדיה מורכבת מסוימת (לדוגמה, שחפת) יכולה להציג אוטופלואורסצנטיות, מה שעלול לגרום לאות רקע עודף.</li>
	</ol></li>
	<li>בועיות הדמיה הערה: תמונות מיקרוסקופיות לדוגמה של שלפוחיות רקומביננטיות VNp ניתן לראות באיור 4.<ol><li>הרכיבו את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים) באמצעות מטרת טבילת שמן והשאירו למשך 2-3 דקות כדי לאפשר לדגימה לשקוע ולטמפרטורה להתאזן. הערה: יש להשלים את כל הדמיית התאים החיים עבור כל דגימה תוך 30 דקות מהרכבת התאים על כיסויים כדי למזער את ההשפעה של פוטוטוקסיות ולחץ אנאירובי. מסיבה זו, תמונות מישור יחיד עדיפות על ערימות z.</li>
		<li>השתמש במקורות אור מתאימים (לדוגמה, דיודה פולטת אור [LED] או נורת הלוגן; ראה טבלת חומרים) ושילובי מסננים עבור החלבונים/הצבעים הפלואורסצנטיים הנמצאים בשימוש6.</li>
		<li>השתמש בעדשה בהגדלה גבוהה (כלומר, 100x או 150x) ובצמצם מספרי גבוה (כלומר, NA ≥1.4) להדמיית התאים המיקרוביאליים והשלפוחיות.</li>
		<li>לקבוע את עוצמת האור המינימלית הנדרשת כדי לדמיין אותות פלואורסצנטיים מתאים ו / או שלפוחיות. פעולה זו עשויה לדרוש התאמה מסוימת של הגדרות החשיפה והרווח עבור המצלמה שבשימוש. הערה: זמני חשיפה אופייניים ממצלמות מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת (CMOS) משתנים בין 50-200 אלפיות השנייה, בהתאם למערכת ההדמיה.</li>
		<li>לתמונות במסגרת בודדת, השתמשו בממוצע של שלוש תמונות כדי להפחית רעשי רקע אקראיים תלויי חומרה.</li>
		<li>להדמיה בהילוך מהיר, המתן 3-5 דקות בין מסגרות בודדות. הערה: בהתאם להגדרת המיקרוסקופ, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את המיקוד לסירוגין במהלך ניסויים ארוכים יותר בהילוך מהיר.</li>
	</ol></li>
</ol>

ייצור והדמיה של שלפוחיות רקומביננטיות מלאות חלבון מאי-קולי

<ol>
	<li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli.">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).</li><li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria.">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).</li><li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria:+Signal+peptide+and+beyond.">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).</li><li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+nature:+rational+design+of+sterile-surface+materials.">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li><li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+in+fission+yeast.">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum.">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles.">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).</li><li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends.">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.

השיטה המתוייגת בפפטיד אמינו-טרמינלי לייצור חלבונים רקומביננטיים שתוארה לעיל היא תהליך פשוט, אשר מניב באופן עקבי כמויות גדולות של חלבון שניתן לבודד ביעילות ו / או לאחסן במשך חודשים.
חשוב להדגיש את השלבים המרכזיים בפרוטוקול הנדרשים לשימוש מיטבי במערכת זו. ראשית, תג VNp1 חייב להיות ממוקם במסוף N, ואחריו החלבון של עניין וכל תגים מתאימים. חשוב גם להימנע משימוש באנטיביוטיקה המכוונת לשכבת הפפטידוגליקן, כגון אמפיצילין.
במונחים של תנאי גידול, מדיה עשירה (למשל, מדיה LB או TB) ויחס שטח פנים:נפח גבוה נחוצים כדי למקסם את ייצור השלפוחית. הטמפרטורה האופטימלית לייצור שלפוחיות חוץ-תאיות היא 37 מעלות צלזיוס, אך יש לקחת בחשבון גם את התנאים הדרושים בדרך כלל לביטוי החלבון המעניין. לטמפרטורות אינדוקציה נמוכות יותר, יש להשתמש ב-VNp6. באופן מכריע, אינדוקציה של מקדם T7 חייבת להיות מושגת באמצעות לא יותר מ 20 מיקרוגרם / מ"ל (84 מיקרומטר) IPTG ברגע שהתאים מגיעים OD600 של 0.8-1.0. חלבונים המבוטאים באמצעות המערכת מגיעים לייצור שלפוחית מקסימלי תוך 4 שעות או לאחר אינדוקציה של לילה.
למרות הפשטות של פרוטוקול זה, הוא דורש אופטימיזציה. היתוך גרסאות VNp, טמפרטורות ביטוי ופרקי זמן אינדוקציה עשויים להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. יתר על כן, יש צורך לייעל את הטיהור ואת הריכוז הבא של שלפוחיות חוץ תאיות מן התקשורת. ההליך הנוכחי אינו ניתן להרחבה ויכול לגזול זמן. אלה המגבלות של מתודולוגיה זו.
לטכנולוגיית VNp יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות2. הוא מאפשר ייצוא שלפוחית של חלבונים מגוונים, כאשר הגודל המקסימלי שבא לידי ביטוי בהצלחה עד כה הוא 175 kDa עבור שלפוחיות שנותרו פנימיות ו 85 kDa עבור אלה המיוצאים. יתר על כן, טכנולוגיה זו יכולה להגדיל באופן משמעותי את התשואה של חלבונים רקומביננטיים עם מגוון תכונות ופעילויות פיזיקליות. ניתן לבודד בועיות מיוצאות המכילות את החלבון המעניין על ידי סינון פשוט מהמדיה שסולקה מראש ולאחר מכן ניתן לאחסן אותן, בתרבית סטרילית או בחיץ, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
היישומים עבור מערכת זו מגוונים, החל ממדע גילוי ועד ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה (למשל, באמצעות ייצור של טיפולים פונקציונליים)3. קלות הייצור, העיבוד במורד הזרם והתשואה הגבוהה הן כולן תכונות אטרקטיביות בתחומים אלה ובמיוחד בתעשייה.

חיידק הגראם-שלילי E. coli הוא מערכת אטרקטיבית לייצור חלבונים רקומביננטיים בקנה מידה תעשייתי ואקדמי כאחד. זה לא רק חסכוני ופשוט לתרבית בקבוצות לצפיפויות גבוהות, אלא הוקם ספקטרום רחב של ריאגנטים, זנים, כלים ומקדמים כדי לקדם את ייצור החלבונים הפונקציונליים ב- E. coli1. בנוסף, טכניקות ביולוגיה סינתטית מתגברות כיום על מכשולים הקשורים בדרך כלל ליישום שינויים לאחר תרגום וקיפול חלבונים מורכבים2. היכולת למקד את הפרשת החלבונים הרקומביננטיים לתרבית אטרקטיבית לשיפור היבול ולהוזלת עלויות הייצור. אריזה מבוקרת של חלבונים המוגדרים על-ידי המשתמש לתוך בועיות הממברנה מסייעת בפיתוח מוצרים וטכנולוגיות בתעשיות הביוטכנולוגיה היישומית והרפואה. עד כה, חסרו שיטות ישימות להפרשת חלבונים רקומביננטיים מ- E. coli 3.
איסטווד ועמיתיו פיתחו לאחרונה שיטה מבוססת תיוג פפטידי לייצור ובידוד שלפוחיות המכילות חלבון רקומביננטי מ- E. coli1. פפטיד נוקלטינג שלפוחית זה (VNp) מאפשר ייצור שלפוחיות קרום חיידקים חוץ-תאיות, שלתוכן ניתן לכוון את החלבון הרקומביננטי המועדף כדי לפשט את הטיהור והאחסון של חלבון המטרה, ומאפשר יבולים גבוהים משמעותית מהמותר בדרך כלל מרעידות תרביות בקבוקים. דווח על תפוקות של קרוב ל-3 גרם חלבון רקומביננטי לליטר תרבית בקבוקים, עם תפוקות גבוהות פי >פי 100 מאלה שהתקבלו עם חלבונים מקבילים חסרי תג VNp. שלפוחיות רקומביננטיות מועשרות בחלבון אלה ניתנות לטיהור וריכוז מהיר ממצע התרבית ומספקות סביבה יציבה לאחסון. טכנולוגיה זו מהווה פריצת דרך משמעותית בייצור חלבון רקומביננטי E. coli. השלפוחיות ממדירות חלבונים רעילים ובעלי קשר דיסולפיד בצורה מסיסים ופונקציונליים, ותומכות בטיהור פשוט, יעיל ומהיר של חלבונים פונקציונליים ארוזים בשלפוחית לאחסון לטווח ארוך או עיבוד ישיר1.
היתרונות העיקריים שטכנולוגיה זו מציגה על פני הטכניקות הנוכחיות הם: (1) הישימות למגוון גדלים (1 kDa עד >100 kDa) וסוגי חלבונים; (2) הקלה על היווצרות קשר דיסולפיד בין-חלבוני ותוך-חלבוני; (3) חל על קומפלקסים רב-חלבוניים; (4) ניתן לשימוש עם מגוון מקדמים וזני E. coli מעבדה סטנדרטיים; (5) הפקת יבולים של חלבונים מרעידות צלוחיות שבדרך כלל רואים רק בתרביות תסיסה; חלבונים מיוצאים ונארזים לבועיות הקשורות לממברנה אשר (6) מספקות סביבה יציבה לאחסון החלבון המסיס הפעיל; ו-(7) מפשט את העיבוד במורד הזרם ואת טיהור החלבונים. כלי חלבון רקומביננטי פשוט וחסכוני זה עשוי להשפיע לטובה על תעשיות הביוטכנולוגיה והרפואה, כמו גם על מדע הגילוי.
כאן, פרוטוקול מפורט, שפותח במשך מספר שנים, מתאר את התנאים האופטימליים לייצור שלפוחיות מלאות חלבון רקומביננטי מחיידקים עם טכנולוגיית VNp. תמונות לדוגמה של מערכת זו בפועל מוצגות, עם חלבון פלואורסצנטי מבוטא, המאפשר נוכחות של שלפוחיות בשלבים שונים של הייצור, טיהור וריכוז כדי להמחיש. לבסוף, ניתנת הדרכה כיצד להשתמש בהדמיה של תאים חיים כדי לאמת את הייצור של בועיות המכילות איחוי VNp מהחיידקים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>56-75-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH10&#946;</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for microscope</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
			<td>T-3166</td>
			<td>Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open Source</td>
			<td></td>
			<td>Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Gibco (Thermofisher Scientific)</td>
			<td>11815-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source for micrscope</td>
			<td>Cairn Research Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB) / LB agar</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metamorph imaging software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF-Millipore Membrane filter (0.1 &#181;m, MCE)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>VCWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 &#181;m, PES)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HPWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)</td>
			<td>Lab Stock</td>
			<td>N/A</td>
			<td>12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized production and analysis of recombinant protein-filled vesicles from e. coli

מערכת חדשנית זו, המשתמשת בתג פפטיד קצר, המייצא חלבונים רקומביננטיים מרובים בשלפוחיות הקשורות לממברנה מ- E. coli, מספקת פתרון יעיל למגוון בעיות הקשורות לביטוי חלבון רקומביננטי חיידקי. שלפוחיות רקומביננטיות אלה ממדירות חלבונים בתוך מיקרו-סביבה המאפשרת ייצור של חלבונים מאתגרים, רעילים, בלתי מסיסים או דיסולפידים המכילים חלבונים מחיידקים. תפוקת החלבון גדלה במידה ניכרת בהשוואה לביטוי חיידקי טיפוסי בהיעדר תג הפפטיד נוקלציית השלפוחית. שחרור חלבונים ארוזים בשלפוחית תומך בבידוד מתווך התרבית ומאפשר אחסון חלבון פעיל לטווח ארוך. טכנולוגיה זו מולידה תפוקות מוגברות של חלבונים פונקציונליים ארוזים בשלפוחית לעיבוד פשוט במורד הזרם עבור מגוון רחב של יישומים, החל מביוטכנולוגיה יישומית ועד מדע גילוי ורפואה. במאמר הנוכחי ובסרטון הנלווה אליו, מובא פרוטוקול מפורט של השיטה, המדגיש שלבים מרכזיים במתודולוגיה למקסום ייצור שלפוחית מלאה בחלבון רקומביננטי.

The Gram-negative bacteria E. coli is an attractive system for recombinant protein production on both industrial and academic scale. It is not only cost-effective and straightforward to culture in batches to high densities, but a broad-spectrum of reagents, strains, tools, and promoters have been established to promote the generation of functional proteins in E. coli1. Additionally, synthetic biology techniques are now overcoming obstacles typically related to the application of post-translational modifications and folding of complex proteins2. The ability to target the secretion of recombinant proteins into culture media is attractive for improving yield and reducing manufacturing costs. Controlled packaging of user-defined proteins into membrane vesicles assists the development of products and technologies within the applied biotechnology and medical industries. Until now, there has been a lack of widely applicable methods for secreting recombinant proteins from E. coli 3.
Eastwood et al.&#160;have recently developed a peptide tagging-based method for producing and isolating recombinant protein-containing vesicles from E. coli1. This Vesicle Nucleating peptide (VNp) allows the production of extracellular bacterial membrane vesicles, into which the recombinant protein of choice can be targeted to simplify purification and storage of the target protein, and allows significantly higher yields than normally allowed from shaking flask cultures. Yields of close to 3 g of recombinant protein per liter of flask culture have been reported, with &#62;100x higher yields than those obtained with equivalent proteins lacking the VNp tag. These recombinant protein-enriched vesicles can be rapidly purified and concentrated from the culture media and provide a stable environment for storage. This technology represents a major breakthrough in E. coli recombinant protein production. The vesicles compartmentalize toxic and disulfide-bond containing proteins in a soluble and functional form, and support the simple, efficient, and rapid purification of vesicle-packaged, functional proteins for long-term storage or direct processing1.
The major advantages this technology presents over current techniques are: (1) the applicability to a range of sizes (1 kDa to &#62;100 kDa) and types of protein; (2) facilitating inter- and intra- protein disulfide-bond formation; (3) applicable&#160;to multiprotein complexes; (4) can be used with a range of promoters and standard lab E. coli strains; (5) the generation of yields of proteins from shaking flasks normally only seen with fermentation cultures; proteins are exported and packaged into membrane bound vesicles that (6) provide a stable environment for storage of the active soluble protein; and (7) simplifies downstream processing and protein purification. This simple and cost-effective recombinant protein tool is likely to have a positive impact on the biotechnology and medical industries, as well as discovery science.
Here, a detailed protocol, developed over several years, describes the optimal conditions to produce recombinant protein-filled vesicles from bacteria with the VNp technology. Example images of this system in practice are shown, with a fluorescent protein being expressed, allowing the presence of vesicles during different stages of the production, purification, and concentration to be visualized. Finally, guidance is provided on how to use live cell imaging to validate the production of VNp fusion-containing vesicles from the bacteria.

מחבר זרקור: ייצור חלבונים רקומביננטיים 

ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי מאי-קולי

We are trying to understand the dynamic interactions between molecules within living cells. For biochemical analysis, it can be necessary to use large quantities of recombinant protein. These can be extremely difficult to express in a correctly-folded and functional form.If a protein was found to be misfolded or insoluble when expressed in bacteria, researchers would either have to resort to mammalian cells, which is expensive and relatively slow, or use synthetic polypeptides. Our protocol allows for high yield expression as well as export of challenging proteins from E.coli. Adding a short cleavable peptide sequence to the amino terminus of the protein not only enhances the production and yield of every protein we have tested to date, but also exports the protein from the cell into the media.Along with simplifying protein expression, it also simplifies downstream protein purification.

BL21 DE3 E. coli המכיל את מבנה הביטוי VNp6-mNeongreen גודלו לשלב רישום מאוחר (איור 2A). ביטוי VNp6-mNeongreen נגרם על ידי תוספת של IPTG לתרבית (20 מיקרוגרם / מ"ל או ריכוז סופי של 84 מיקרומטר), אשר לאחר מכן נשאר לגדול בן לילה ב 37 ° C עם רעידות נמרצות (200 סל"ד, ≥ 25 מ"מ זריקה מסלולית). למחרת בבוקר, התרבית הראתה פלואורסצנטיות mNeongreen7 (איור 2B), שנשארה גלויה בתקשורת לאחר הסרת תאי חיידקים באמצעות צנטריפוגה (איור 2C). הנוכחות של VNp-mNeongreen בתוך מדיה תרבותית ותרבותית מנוקה אושרה על-ידי SDS-PAGE (איור 2D). השלפוחיות המכילות mNeongreen בודדו לתוך מסנן MCE של 0.1 מיקרומטר (איור 2E) והושעו מחדש ב-PBS (איור 2F). השלפוחיות המטוהרות הורכבו לאחר מכן על משטח אגרוז (איור 3A-C) וצולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה (איור 4A). נוכחותם של קרומי שלפוחית אושרה באמצעות הצבע הפלואורסצנטי הליפופילי FM4-64 (איור 4B). תאי E. coli המבטאים את חלבון הממברנה הפנימית CydB התמזגו עם mNeongreen (ירוק) ו-VNp6-mCherry2 (מגנטה)8 מראים ייצור שלפוחית והחדרת מטען בתאי חיידקים חיים (איור 4C). איור 4A,B נלכד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה, ואילו איור 4C נרכש באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), בשיטות שתוארו קודם לכן 9,10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg"> איור 1: סיכום טכנולוגיית VNp מתכנון אסטרטגיית שיבוט ועד לטיהור ואחסון של שלפוחיות חוץ-תאיות . (A) סכמה של חלבון היתוך VNp טיפוסי. VNp במסוף NH2, ואחריו מקשר גמיש ושילוב מתאים של תגי זיקה ופלואורסצנטיות (Tag1, Tag 2, אתר מחשוף פרוטאז [למשל, TEV]) וחלבון מעניין. (B) תרשים סכמטי המסכם את פרוטוקול הביטוי והטיהור של שלפוחיות קרום מלאות חלבון רקומביננטי מ- E. coli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg"> איור 2: שלבי ייצור וטיהור של שלפוחיות VNp6-mNg. תרביות של תאי E. coli המכילים את הביטוי VNp-mNeongreen נבנות באור כחול לפני (A) או אחרי (B) ביטוי המושרה על ידי IPTG של חלבון ההיתוך. התאים מ-(B) הוסרו באמצעות צנטריפוגה, והותירו שלפוחיות מלאות VNp-mNeongreen במדיה (C). (D) דגימות שוות ערך מ-A, B ו-C נותחו על ידי SDS-PAGE וצביעת קומאסי. השלפוחיות בודדו למסנן של 0.1 מיקרומטר (E) ולאחר מכן נשטפו לנפח חיץ מתאים (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg"> איור 3: הליך הרכבת תאים להדמיית בועיות וייצור שלפוחיות. (A-C) שיטת כרית אגרוז (D-F) שיטת PEI להרכבת תאי E. coli על הכיסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg"> איור 4: תמונות מיקרוסקופיה של שלפוחיות רקומביננטיות VNp. תמונות פליטה ירוקות (A) ואדומות (B) משדות שונים של FM4-64 המסומנות בשלפוחיות המכילות VNp6-mNeongreen המותקנות על פד אגרוז. (C) הדמיה של תאי E. coli המבטאים את חלבון הממברנה הפנימית CydB המאוחה ל-mNeongreen (ירוק) ו-VNp6-mCherry2 (מגנטה) מראה ייצור שלפוחית והחדרת מטען לתאי חיידקים חיים. (A,B) צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה, ואילו (C) נרכש באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM). פסי קנה מידה: (A,B) = 10 מיקרומטר; (C) = 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Production of Recombinant Proteins at JoVE.com

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה מפורטת לייצור חיידקים של חלבונים רקומביננטיים, כולל חלבונים המכילים בדרך כלל קשרים בלתי מסיסים או דיסולפידים, ארוזים בתוך שלפוחיות חוץ-תאיות הקשורות לקרום. יש לכך פוטנציאל להיות מיושם בתחומים מגוונים של מחקר מדעי, כולל ביוטכנולוגיה יישומית ורפואה.

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an ...

אנו מנסים להבין את יחסי הגומלין הדינמיים בין מולקולות בתוך תאים חיים. עבור ניתוח ביוכימי, זה יכול להיות נחוץ להשתמש בכמויות גדולות של חלבון רקומביננטי. אלה יכולים להיות קשים מאוד לבטא בצורה מקופלת נכונה ופונקציונלית.אם חלבון נמצא מקופל בצורה שגויה או בלתי מסיס כאשר הוא מתבטא בחיידקים, החוקרים יצטרכו לפנות לתאי יונקים, שהם יקרים ואיטיים יחסית, או להשתמש בפוליפפטידים סינתטיים. הפרוטוקול שלנו מאפשר ביטוי תפוקה גבוהה וכן ייצוא חלבונים מאתגרים מ-E.coli. הוספת רצף פפטידי קצר למסוף האמינו של החלבון לא רק משפרת את הייצור והתשואה של כל חלבון שבדקנו עד היום, אלא גם מייצאת את החלבון מהתא לתקשורת.יחד עם פישוט ביטוי החלבון, הוא גם מפשט את טיהור החלבונים במורד הזרם.

optimized-production-analysis-recombinant-protein-filled-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

4.9K Views.  University of Kent. אנו מנסים להבין את יחסי הגומלין הדינמיים בין מולקולות בתוך תאים חיים. עבור ניתוח ביוכימי, זה יכול להיות נחוץ להשתמש בכמויות גדולות של חלבון רקומביננטי. אלה יכולים להיות קשים מאוד לבטא בצורה מקופלת נכונה ופונקציונלית.אם חלבון נמצא מקופל בצורה שגויה או בלתי מסיס כאשר הוא...

Video: מחבר זרקור: ייצור חלבונים רקומביננטיים 

This innovative system, using a short peptide tag, that exports multiple recombinant proteins in membrane bound vesicles from E. coli, provides an effective solution to a range of problems associated with bacterial recombinant protein expression. These recombinant vesicles compartmentalise proteins within a micro-environment that facilitates the production of otherwise challenging, toxic, insoluble, or disulfide-bond containing proteins from bacteria. Protein yield is increased considerably when compared to typical bacterial expression in the absence of the vesicle-nucleating peptide tag. The release of vesicle-packaged proteins supports isolation from the culture medium&#160;and permits long-term active protein storage. This technology gives rise to increased yields of vesicle-packaged, functional proteins for simplified downstream processing for a diverse range of applications from applied biotechnology to discovery science and medicine. In the present article and the associated video, a detailed protocol of the method is provided, which highlights key steps in the methodology to maximize recombinant protein-filled vesicle production.

The present protocol describes a detailed method for the bacterial production of recombinant proteins, including typically insoluble or disulfide-bond containing proteins, packaged inside extracellular membrane-bound vesicles. This has the potential to be applied to versatile areas of scientific research, including applied biotechnology and medicine.

Recombinant Vescicle Isolation from Bacterial Culture to Release Soluble Protein

After cloning the vesicle nucleating peptide, or VNP sequence tag, at the amino terminal of the fusion protein, culture a five-milliliter lysogeny broth, or LB starters, from fresh bacterial transformations at 37 degrees Celsius to saturation. Then, use that to inoculate 25 milliliters of terrific broth, or TB, containing appropriate antibiotic selection in a 500-milliliter conical flask. Incubate the flask in an incubator at 37 degrees Celsius while shaking at 200 rotations per minute or greater than equal to a 25-millimeter orbital throw until the culture reaches a 600-nanometer optical density value, or OD 600, of 0.8 to 1.0.Then, induce recombinant protein expression from the T7 promoter by adding IPTG to a final concentration of up to 20 micrograms per milliliter or 84 micromolar. After allowing sufficient time for induction, pellet the cells by centrifugation at 3000 G at 4 degrees Celsius for 20 minutes. Pass the supernatant through a sterile and detergent free 0.45 micron PES filter to sterilize the vesicle containing media for long-term storage.To concentrate the vesicles into a smaller volume, pass the sterile vesicle containing media through a sterile and detergent free 0.1 micron MCE filter. Then, gently wash the membrane with 0.5 to 1 milliliters of sterile phosphate-buffered saline, or PBS, and use a cell scraper or plastic spreader to carefully remove vesicles from the membrane. Transfer the vesicle concentrate to a fresh micro centrifuge tube using a pipette.Purified vesicles can be stored at four degrees Celsius. Sonicate the protein containing vesicles in the sterile media using an appropriate schedule to disrupt the vesicular lipid membranes and release protein. Centrifuge the sonicated suspension at 39, 000 G and 4 degrees Celsius for 20 minutes to remove the vesicular debris.BL21DE3 Escherichia coli containing the VNp6-mNeongreen expression construct displayed mNeongreen fluorescence being induced overnight with IPTG. The fluorescence remained visible in the culture after the removal of bacterial cells by centrifugation. The presence of VNp-mNeongreen within the culture in cleared culture media was confirmed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.The resuspended purified vesicles in PBS also displayed fluorescence.

בידוד שלפוחית רקומביננטית מתרבית חיידקים לשחרור חלבון מסיס

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy  

To stain the vesicle membrane, add the fluorescent lipid dye FM4-64 to the purified vesicles at a final concentration of two micromolar and incubate for 10 minutes before imaging. After isolating the protein filled vesicles from Escherichia coli culture, pipette the purified vesicles onto a less than one millimeter thin circular 2%LB agarose pad that has been allowed to form and set on a clean glass slide. Once the liquid has dried, place a 50 millimeter by 25 millimeter cover slip over the vesicles on the pad.Hold the cover slip in place with spacers and adhesive tape. Then mount the slide onto an inverted microscope using an oil immersion objective, and leave the sample for two to three minutes to settle and the temperature to equilibrate. For single frame images, use three image averaging to reduce hardware dependent random background noise.For time-lapse imaging, allow three to five minutes between individual frames. Widefield fluorescence microscopy imaging showed the purified amnion green containing vesicles. The lipophilic fluorescent dye, FM4-64, confirmed the presence of vesicle membranes.Structured illumination microscopy of the live bacterial cells expressing the inner membrane protein, CydB, fused to amnion green, and VNp6-mCherry2 showed vesicle production and cargo insertion.