עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NO.81860413, 81960455), קרן מחלקת המדע והטכנולוגיה של יונאן (202001AY070001-080), קרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2019J1274).

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים לסרטן יונאן/בית החולים המסונף השלישי של האוניברסיטה הרפואית של קונמינג. כל הנבדקים/אפוטרופוסים חתמו על הסכמה מדעת.
1. הכנת שקופיות
<ol><li>חתכו מקטעים של גושי פרפין זוגיים המכילים גידול ריאתי ראשוני או סרטן ריאות במוח שולח גרורות לתאים בעובי של 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום. מוציאים חלקים למים ומפרידים עם פינצטה, בוחרים את הטוב ביותר ומדביקים אותו על המגלשה המצופה פוליליזין.</li>
	<li>הכניסו את מגלשות הרקמות לתנור בטמפרטורה של 65°C למשך 30 דקות כדי לשפר את הידבקות הרקמות.</li>
	<li>סחפו את השקופיות בקסילן באמצעות שלושה שינויים, שכל אחד מהם נמשך 10 דקות.</li>
	<li>הפחיתו בהדרגה את ריכוז האלכוהול ודגרו על מגלשות ב-100% אתנול למשך 5 דקות, 90% אתנול למשך 5 דקות, 75% אתנול למשך 5 דקות ובמים נטולי יונים, למשך 3 דקות.</li>
</ol>2. אחזור אפיטופים המושרה בחום (HIER)
<ol><li>לדלל 100x נתרן ציטראט תמיסת חיץ (pH 6.0) ל 1x (10 mM) במים deionized, הכנת מספיק תמיסת חיץ כדי לטבול לחלוטין את המגלשות.</li>
	<li>הניחו את המגלשות בסיר לחץ, וחשפו אותן לחום גבוה (100 מעלות צלזיוס) ולחץ (~ 30 psi) למשך 2 דקות. לאחר החימום, מניחים למגלשות להתקרר לטמפרטורת החדר במים מזוקקים למשך 3 דקות.</li>
	<li>יש להמיס שקיק אחד של 52 גרם של מלח חוצץ פוספט (PBS; אבקה) ב-5 ליטר מים נטולי יונים, להכנת תמיסת חיץ PBS (pH 7.0). מקם את השקופיות בתמיסת חיץ PBS למשך 5 דקות, עם 3 שינויים.</li>
</ol>3. חסימת פרוקסידז
<ol><li>מכסים את החלקים במי חמצן 3% ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את המגלשות ב-PBS, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת.</li>
	<li>השתמש בנייר מסנן כדי לספוג עודפי מים הרחק מהיקף הרקמה. בינתיים, ודא כי הרקמה לחה.</li>
</ol>4. דגירה ראשונית של נוגדנים לסיבוב ראשון
<ol><li>הכינו תערובת עבודה של הנוגדנים הראשוניים עבור CD8 (נוגדן חד שבטי ארנב, שיבוט SP16) ו- CD20 (נוגדן חד שבטי עכבר, שיבוט L26), מדולל 1:50 בדילול נוגדנים ראשוני של בונד.</li>
	<li>מוסיפים את קומפלקס הנוגדנים לחלקים ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכינו תמיסה של 0.1% תמיסת מלח חוצצת טווין/פוספט: 1 מ"ל של טווין ב-1 ליטר של תמיסת חיץ PBS.</li>
	<li>שטפו את החלקים במי מלח חוצצים ב-0.1% טווין/פוספט, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. השתמש בנייר סינון כדי למשוך עודפי מים מהיקף הרקמה, בינתיים, ודא שהרקמה לחה.</li>
</ol>5. דגירה משנית של נוגדנים לסיבוב ראשון
<ol><li>הכינו תערובת של נוגדן עז נגד ארנבים (Excitation) עם תווית פלואורסצנטית (Excitation): 495 ננומטר) ונוגדן נגד עכבר עיזים (לדוגמה: 578 ננומטר), מדולל 1:50 במי מלח של חיץ פוספט. נוגדן נגד ארנב עיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CD8, והנוגדן נגד עכבר עיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CD20.</li>
	<li>מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית בטיפה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.</li>
</ol>6. שליפת אפיטופים כתוצאה מחום וחסימת פרוקסידז
<ol><li>לדלל 100x נתרן ציטראט (pH 6.0) ל 1x (10 mM) במים deionized, הכנת מספיק תמיסת חיץ כדי לטבול לחלוטין את המגלשות.</li>
	<li>הניחו את המגלשות בסיר לחץ וחשפו אותן לחום גבוה (100°C) ולחץ (~30 psi) למשך דקה אחת. לאחר החימום, הניחו את המגלשות במים מזוקקים להתקרר לטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.</li>
	<li>בצע חסימת פרוקסידז כמתואר בשלב 3.</li>
</ol>7. דגירה ראשונית של נוגדנים לסיבוב שני
<ol><li>הכינו תערובת עבודה של הנוגדנים הראשוניים עבור CD3 (נוגדן חד שבטי ארנב, שיבוט SP7) ו- CK (נוגדן חד שבטי עכבר, MX005), מדולל 1:50 בדילול נוגדנים ראשוני.</li>
	<li>מוסיפים את קומפלקס הנוגדנים לחלקים ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף עם 0.1% מלח טווין/חוצץ פוספט, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד. השתמש בנייר סינון כדי למשוך עודפי מים מהיקף הרקמה, בינתיים, ודא שהרקמה לחה.</li>
</ol>8. דגירה שניונית של נוגדנים לסיבוב שני
<ol><li>הכינו תערובת נגד ארנב עיזים (לדוגמה: 652 ננומטר) ונוגדנים נגד עכברים (לדוגמה: 590 ננומטר), דילול 1:50 במי מלח חיץ פוספט. הנוגדן נגד ארנב העיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CD3, והנוגדן נגד עכבר העיזים מתחבר לנוגדן הראשוני של CK.</li>
	<li>מוסיפים את תערובת הנוגדנים המשנית בטיפת חלב, דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. יש לשטוף עם 0.1% מלח טווין/חוצץ פוספט, 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד.</li>
</ol>9. מרווה אוטופלואורסצנטית וצביעה DAPI
<ol><li>הוסף מגיב (0.15 M/L KMnO4) למקטע הרקמה למשך דקה אחת. יש לשטוף במים זורמים במשך 5 דקות. אזהרה: KMnO4 רעיל ומזיק לעור. הקפידו ללבוש כפפות בעת הטיפול במגלשות. אם הנוזל מטפטף על העור, נגבו אותו במהירות עם מפיות נקיות ושטפו אותו במים זורמים.</li>
	<li>יבש את המגלשה עם ריכוזים הולכים וגדלים של אלכוהול (70%, 90%, 100%), במשך 3 דקות בכל ריכוז.</li>
	<li>הוסף DAPI ו- coverslip להדמיה מולטיספקטרלית. כמות DAPI תלויה בגודל הרקמה. ודא שהרקמה מכוסה לחלוטין על ידי DAPI לאחר הוספת הכיסוי.</li>
</ol>10. סריקת שקופיות
<ol><li>הניחו את המגלשות על מגש ודחפו עד שלא ניתן לדחוף אותן הלאה.</li>
	<li>כדי להפעיל את התוכנית, לחץ פעמיים על סמל התוכנית בשולחן העבודה. במהלך ההפעלה, מוצג חלון בחירת המצב. חלון הבחירה מציג שני מצבי שדה בהיר ומצב פלואורסצנטי: מצב אוטומטי ומצב ידני. במצב סריקה פלואורסצנטית, לחץ על מצב אוטומטי.</li>
	<li>העבר את סמן העכבר ? כדי להציג את המידע אודות ההגדרות. לחצו על 'הגדרת מסנן' > 'ערוץ מסנן ' כדי לבחור את 'מספר ערוץ' > 'צבע מדומה'. הגדר את הצבע ושמור.</li>
	<li>לחץ על עבודה שגרתית > מצב סריקה > אוטומטי מלא. לחץ על עבודה שגרתית > שם שקופית כדי להגדיר שם שקופית עבור פלט. לחץ על עבודה שגרתית > הגדרות ערוץ כדי לבחור מסננים.</li>
	<li>לחץ על Routine Work > Scan Options כדי לקבוע את האיכות ומיקום האחסון המתקבלים של השקופית הווירטואלית.</li>
	<li>לחץ על תצוגה מקדימה להגדרת סף ולבחירת הטווח לסריקה.</li>
	<li>לחץ על מסנני > חומרה > Live > מיקוד אוטומטי > חשיפה אוטומטית > רווח דיגיטלי > Tick השתמש בזמן חשיפה ידני > Tick המגביל את הטווח > הגדרת הנוכחי.</li>
	<li>לחץ על עבודה שגרתית > התחל סריקה. בחר רמת הגדלה כ- 20x או 40x. בחר 20x עבור גדלי קבצים מתאימים. הרחבת MRXS מוגדרת על ידי סורק 3D Pannoramic MIDI. ניתן גם לשנות את סיומת התמונה לתמונת TIFF.</li>
	<li>לחץ/י על ״מציג השקופיות״ >-Multiview Toolbox כדי לבחור את התמונה עבור confocal, ולאחר מכן יישרו ושלבו את התמונה.</li>
</ol>11. הערכה כמותית של צפיפות תאים
<ol><li>כמת אחוזים של תאי חיסון חיוביים (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) באזורי גידול וסטרומה באמצעות תוכנת סורק Halo 10. אימות צביעת CK כדי להגדיר רקמת גידול.</li>
</ol>

זיהוי אימונוהיסטוכימי באתרו של סמנים של תאי מערכת החיסון ברקמות סרטניות

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.

תיארנו את התהליך של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מחזורית מרובה. בחירת הנוגדנים הראשונית היא היבט מכריע של בדיקת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית, ונוגדנים חד-שבטיים מומלצים לספציפיות וחזרתיות טובות יותר. כדי לייעל את ריכוז העבודה של הנוגדן הראשוני, סדרה של דילולים נבדקו באמצעות ...

גרורות במוח (BM) מייצגות את הגידולים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתרחשים בכמעט מחצית ממקרי סרטן הריאה של תאים לא קטנים (NSCLC), עם פרוגנוזה גרועה1. על פי הערכות, ל-10%-20% מחולי NSCLC כבר יש BM בזמן האבחנה הראשונית, וכ-40% ממקרי NSCLC יפתחו BM במהלך הטיפול2. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) קשורה קשר הדוק עם התרחשות NSCLC ו-BM, כולל רכיבים שונים, כגון כלי דם, פיברובלסטים, מקרופאגים, מטריצה חוץ-תאית (ECM), לימפואיד, תאים חיסוניים שמקורם במח עצם ומולקולות איתות 3,4. תאי חיסון מיקרו-סביבתיים ממלאים תפקיד מכריע בהשפעה על גדילה והתפתחות של תאים סרטניים. גרורות במוח מציגות מטרות טיפול פוטנציאליות רבות המאופיינות במיקרו-סביבות אימונולוגיות מורכבות ובתהליכי איתות. לדוגמה, מעכבי PD-1 הראו יעילות קלינית עבור חולים עם גרורות במוח של סרטן ריאות (LCBM) כמעכב מחסום חיסוני (ICI). עם זאת, תדירות התגובות לטיפול ב-PD-1 משתנה בין NSCLC ראשוני ל-LCBM5, מה שמרמז על כך שהמיקרו-סביבה החיסונית של הגידול פועלת כמווסת ICI קריטי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא כלי רב ערך בתחומי הביולוגיה, רפואת היסוד והפתולוגיה6. שיטת זיהוי זו ממחישה ביטוי אנטיגן באמצעות אינטראקציה של נוגדן אנטיגן על שקופיתרקמה 7. IHC משמש לאבחון סמנים מנבאים, הערכת סמנים פרוגנוסטיים, הנחיית טיפולים ממוקדים וחקירת התפקודים הביולוגיים של תאי גידול8. עם זאת, שיטת IHC המסורתית יכולה לזהות רק סמן ביולוגי אחד בכל פעם. כדי להתמודד עם מגבלה זו, החדשנות של הטכנולוגיה האימונוהיסטוכימית הובילה לפיתוח אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת משתתפים (mfIHC), המאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים חלבוניים מרובים על אותה שקופית רקמה, הן בשדה בהיר והן בשדה פלואורסצנטי9. התקדמות זו מספקת ניתוח מדויק של הרכב התאים והאינטראקציות המולקולריות בין תאי סטרומה, תאי מערכת החיסון ותאי סרטן בתוך TME.
במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה מחזורית מרובת משתתפים לניתוח ההתפלגות המרחבית של תאי מערכת החיסון. שני נוגדנים ראשוניים ממינים שונים, כגון ארנב וחולדה, נבחרים לדגירת דגירה בו זמנית, ולאחר מכן נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנטיות. שליפת אנטיגן מתבצעת לאחר כל סבב של תגובת אנטיגן-נוגדנים. אוטופלואורסצנטיות חסומה, ו-4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) משמש להכתמת הגרעינים. הפאנל כולל זיהוי רציף של CD3, CD8, CD20 ו- CK, תאים מסווגים לפי הסמנים: תאי גידול (CK+), תאי T בוגרים (CD3+), תאי T ציטוטוקסיים (CD3+CD8+), תאי B (CD20+)10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

המיקרו-סביבה של הגידול כוללת אינטראקציות בין תאים מארחים, תאי גידול, תאי חיסון, תאי סטרומה וכלי דם. אפיון וארגון מרחבי של תת-קבוצות תאי חיסון וחלבוני מטרה חיוניים למטרות פרוגנוסטיות וטיפוליות. זה הוביל לפיתוח של שיטות צביעה immunohistochemistry multiplexed. אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים מרובים, מה שמקל על הבנה מקיפה של תפקוד התא ואינטראקציות בין-תאיות. במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה עבור בדיקת אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת מחזורים ויישומה בניתוח הכימות של תת-קבוצות לימפוציטים. צביעת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית המחזורית המרובבת עוקבת אחר שלבים וריאגנטים דומים לאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית, וכוללת שליפת אנטיגן, דגירה מחזורית של נוגדנים וצביעה על שקופית רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין (FFPE). במהלך תגובת האנטיגן-נוגדנים מכינים תערובת של נוגדנים ממינים שונים. תנאים, כגון זמן אחזור אנטיגן וריכוז נוגדנים, ממוטבים ומאומתים כדי להגדיל את יחס האות לרעש. טכניקה זו ניתנת לשחזור ומשמשת כלי רב ערך למחקר אימונותרפיה וליישומים קליניים.

Brain metastases (BM) represent the most common central nervous system (CNS) tumors, occurring in nearly half of non-small cell lung cancer cases (NSCLC), with a poor prognosis1. An estimated 10%-20% of NSCLC patients already have BM at the time of initial diagnosis, and approximately 40% of NSCLC cases will develop BM during the course of treatment2. The tumor microenvironment (TME) is closely associated with NSCLC occurrence and BM, including various components, such as blood vessels, fibroblasts, macrophages, extracellular matrix (ECM), lymphoid, bone marrow-derived immune cells, and signaling molecules3,4. Microenvironmental immune cells play a crucial role in influencing cancer cell growth and development. Brain metastases present numerous potential treatment targets characterized by complex immunological microenvironments and signaling processes. For instance, PD-1 inhibitors have shown clinical efficacy for patients with lung cancer brain metastasis (LCBM) as an immune-checkpoint inhibitor (ICI). However, the frequency of responses to PD-1 therapy varies between primary NSCLC and LCBM5, suggesting that the tumor immune microenvironment acts as a critical ICI regulator.
Immunohistochemistry (IHC) is an invaluable tool in the fields of biology, foundation medicine, and pathology6. This detection method visualizes antigen expression through the interaction of antigen-antibody on a tissue slide7. IHC is used for diagnosing predictive markers, evaluating prognostic markers, guiding targeted therapies, and exploring the biological functions of tumor cells8. However, the traditional IHC method can only detect one biomarker at a time. To address this limitation, the innovation of immunohistochemical technology has led to the development of multiplex fluorescence immunohistochemistry (mfIHC), which allows for the simultaneous identification of multiple protein markers on the same tissue slide, both in bright field and fluorescent field9. This advancement provides accurate analysis of cell composition and molecular interactions among stromal cells, immune cells, and cancer cells within the TME.
In this study, we present a protocol for multiplex cyclic immunohistochemistry to analyze the spatial distribution of immune cells. Two primary antibodies of different species, such as rabbit and rat, are chosen for incubation simultaneously, followed by fluorescence-labeled secondary antibodies. Antigen retrieval is performed after each round of antigen-antibody reaction. Autofluorescence is blocked, and 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is used for staining the nuclei. The panel includes sequential detection of CD3, CD8, CD20, and CK, cells are categorized according to the markers: tumor cells (CK+), mature T cells (CD3+), cytotoxic T cells (CD3+CD8+), B cells (CD20+)10,11.

מחבר זרקור: זיהוי יעיל של חדירת תאי מערכת החיסון לרקמות סרטניות באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית

אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת משתתפים

The challenge for immunohistochemistry is to choose the species of primary and secondary monoclonal antibodies to avoid cross-reactivity and obtain better specificity and repeatability. Gender decision is necessary to optimize the antibody dilution ratio. Meanwhile, another challenge is to align the localization of and the sub structures.The use of this protocol meet the technical evolution of the distribution of three lymphocytic subpopulations, such as CT three, positive CT three, and CT eight positive and CT 20 positive based on in cell counts and the protein expression in conserv tissues, the level of infiltration can be observed too. In our protocol, the parameter Antibodies and the Fluor secondary antibodies derive from different species at the iso mixture making us a efficient. This measure also shows a specific measure between antibody and antigen.

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אנטיגן מחזורי באמצעות פלואורסצנטיות מרובת 5 צבעים בשקופית אחת. באמצעות האופטימיזציה שלנו של הבדיקה, אנו מאפשרים דגירה של שני נוגדנים ממינים שונים (איור 1). המכשירים הדרושים להליך הניסוי כוללים סיר לחץ וקופסת צביעה חיסונית (איור 2A)...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

אימונוהיסטוכימיה מחזורית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי באתרו של סמנים מרובים בו זמנית באמצעות דגירה חוזרת של נוגדני אנטיגן, סריקת תמונה ויישור תמונה ואינטגרציה. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הפעולה לזיהוי מצעי תאי מערכת החיסון בטכנולוגיה זו בסרטן ריאות ובדגימות גרורות מוחיות זוגיות.

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

האתגר עבור אימונוהיסטוכימיה הוא לבחור את המינים של נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים ומשניים כדי למנוע תגובתיות צולבת ולקבל ספציפיות וחזרתיות טובות יותר. החלטה מגדרית נחוצה כדי לייעל את יחס דילול הנוגדנים. בינתיים, אתגר נוסף הוא ליישר את הלוקליזציה של ותתי המבנים.השימוש בפרוטוקול זה עונה על ההתפתחות הטכנית של התפלגות שלוש תת-אוכלוסיות לימפוציטיות, כגון CT שלוש, CT חיובי שלוש, CT שמונה חיובי ו-CT 20 חיובי בהתבסס על ספירת התאים וביטוי החלבונים ברקמות השימור ניתן לראות גם את רמת ההסתננות. בפרוטוקול שלנו, הפרמטר נוגדנים ונוגדנים משניים פלואור נובעים ממינים שונים בתערובת ISO מה שהופך אותנו ליעילים. מדד זה מראה גם מדד ספציפי בין נוגדנים לאנטיגן.

multiplex-cyclic-fluorescent-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

472 Views.  The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University & Yunnan Cancer Hospital. האתגר עבור אימונוהיסטוכימיה הוא לבחור את המינים של נוגדנים חד-שבטיים ראשוניים ומשניים כדי למנוע תגובתיות צולבת ולקבל ספציפיות וחזרתיות טובות יותר. החלטה מגדרית נחוצה כדי לייעל את יחס דילול הנוגדנים. בינתיים, אתגר נוסף הוא ליישר את הלוקליזציה של ותתי המבנים.השימוש בפר?...

Video: מחבר זרקור: זיהוי יעיל של חדירת תאי מערכת החיסון לרקמות סרטניות באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and spatially organizing immune cell subsets and target proteins are crucial for prognostic and therapeutic purposes. This has led to the development of multiplexed immunohistochemistry staining methods. Multiplex fluorescence immunohistochemistry allows the simultaneous detection of multiple markers, facilitating a comprehensive understanding of cell function and intercellular interactions. In this paper, we describe a workflow for the multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry assay and its application in the quantification analysis of lymphocyte subsets. The multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry staining follows similar steps and reagents as standard immunohistochemistry, involving antigen retrieval, cyclic antibody incubation, and staining on a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue slide. During the antigen-antibody reaction, a mixture of antibodies from different species is prepared. Conditions, such as antigen retrieval time and antibody concentration, are optimized and validated to increase the signal-to-noise ratio. This technique is reproducible and serves as a valuable tool for immunotherapy research and clinical applications.

Multiplex cyclic immunohistochemistry allows in situ detection of multiple markers simultaneously using repeated antigen-antibody incubation, image scanning, and image alignment and integration. Here, we present the operating protocol for identifying immune cell substrates with this technology in lung cancer and paired brain metastasis samples.