מימון לפרוטוקול זה ניתן על ידי תוכנית NICHD Intramural ל- KWR (ZIA HD009002-01). אנו מודים לג'ף פארל ולמעבדתו על המשוב מאיר העיניים שלהם, לוויל אנדרסון על התמיכה הטכנית המצוינת, ליאן יאנוצ'י על בדיקת הפרוטוקול ומדידת הקרינה, ולמתקן דגי הזברה המשותף של NIH על עבודתם הקשה בשמירה על בריאות דגי הזברה.

חקירת פיתוח באמצעות מניפולציה של איתות אופטוגנטי בדגי זברה

למחברים אין מה לחשוף.

הזרקת mRNA היא האסטרטגיה הנוכחית לספק bOpto-BMP/Nodal לעוברים של דגי זברה. שיטה זו יש כמה חסרונות. ראשית, הכמות המתאימה של mRNA משתנה בין מעבדות. הכמות המשמשת צריכה להספיק להפעלת איתות חזק עם חשיפה לאור, אך ללא הפעלה חשוכה בשוגג. זה רעיון טוב לבדוק כמה כמויות כדי למצוא רמות mRNA אופטימליות, ולאחר התבססות, ליצור aliquots של תערובת אב כדי לשחזר את אותה כמות של mRNA. שנית, פיזור לא אחיד של mRNA מוזרק עלול להוביל להפעלת איתות לא אחיד. הזרקה למרכז התא (לא לחלמון) נחשבת כמקדמת אפילו פיזור mRNA. לבסוף, מכיוון ש-mRNA מוזרק מתפרק עם הזמן, גישה זו עשויה שלא להתאים לניסויים בעוברים ישנים יותר. בעתיד, בעיות אלה יוכלו להיות מטופלות על ידי קווי דגי זברה טרנסגניים המבטאים בכל מקום bOpto-BMP/Nodal עם מקדם אימהי או תרופתי הניתן להשראת סמים. למרות שעבודה עם דגי זברה בוגרים רגישים לאור עשויה להיות אתגר בהקשר זה, דגי זברה 61,62 ודרוזופילה 22,34,35,63 טרנסגניים בעלי כלים אופטוגנטיים פותחו בהצלחה.
הימנעות מפוטואקטיבציה בשוגג היא אתגר כללי עם כלים אופטוגנטיים. לשם הפשטות, יש להתייחס לעוברים מוזרקים מעל 1.5 HPF כרגישים לאור. לעתים קרובות ניתן להימנע מחשיפה לא מכוונת לאור פשוט על ידי עטיפת צלחות או כלים ברדיד אלומיניום. עם זאת, עבור ניסויים הדורשים תצפית חזותית של עוברים חיים מעל 1.5 hpf, ניתן להשתמש במקורות אור אדום או לכסות מקורות אור לבן עם נייר מסנן ג'ל זול החוסם אורכי גל dimerizing LOV (טבלה של חומרים).
קופסת האור המתוארת כאן מיועדת ליישומים ספציפיים הדורשים שליטה מדויקת על רמות קרינת האור, הדינמיקה ואורכי הגל (איור 2). יתרונות נוספים של קופסת אור זו כוללים חשיפה אחידה לאור, חימום דגימה זניח בשוגג, מקום רב למספר לוחות בעלי 6 בארות, ומקורות אור בעלי תוחלת חיים ארוכה ומאופיינים היטב מבחינה ספקטרלית. עם זאת, אסטרטגיות חשיפה שונות לאור עשויות להיות עדיפות בהתאם ליישום המחקר. מעבדות רבות פיתחו מערכות חשיפה אחידות פשוטות וחסכוניות יותר לאור עם טביעות רגל קטנות יותר, כולל ציפוי אינקובטורים עם פסי LED, תליית לוחות LED מעל דגימות, או שילוב נורות LED במכסי צלחת תרבית 32,38,39,40,64,65,66. חשוב לציין, תיבת האור המשמשת בפרוטוקול זה אינה מאפשרת למשתמשים לווסת באופן עצמאי בארות בודדות (בניגוד ל- Bugaj et al.52) או לספק שליטה מרחבית על החשיפה לאור. הפעלה אופטוגנטית מקומית מרחבית הודגמה עם bOpto-BMP38 ו- bOpto-Nodal39 באמצעות לייזרים במערכות SPIM או קונפוקליות, בהתאמה, ומומשה גם עם אסטרטגיות אופטוגנטיות רבות אחרות במגוון מערכות מודל (נדון ברוג'רס ומולר12). גישות מסוימות אף השיגו רזולוציה מרחבית תת-תאית 29,30,31. למרות שיישום מערכות חשיפה לאור מקומיות מרחבית הוא מחוץ לתחום פרוטוקול זה, ניסויי הפעלה מרחבית עם bOpto-BMP/Nodal אפשריים תיאורטית עם ציוד מיוחד כגון מכשירי מיקרו-מראה דיגיטליים או גישות מיסוך. הקוראים מוזמנים לחקור את הספרות הנרחבת על קופסאות אור DIY לניסויים אופטוגנטיים לפני שהם מתחייבים לאסטרטגיית חשיפה לאור (ראו למשל, Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar and Khammash 53 ועוד at https://www.optobase.org/materials/).
אסטרטגיות אופטוגנטיות מולקולריות מציעות לעתים קרובות רמה גבוהה יותר של שליטה מרחבית-זמנית על תהליכים ביולוגיים בהשוואה לגישות היסטוריות כגון מוטנטים, ביטוי גנים חוץ רחמי, חלבונים רקומביננטיים ותרופות. קוראים המעוניינים ביתרונות של גישות אופטוגנטיות יכולים לחקור כלים אחרים שפורסמו בדגי זברה ובאורגניזמים אחרים. אלה כוללים כלים למניפולציה של מסלולי איתות נוספים 32,65,67,68, ויסות ביטוי גנים 61,64,66,69,70,71, שינוי לוקליזציה של חלבונים 31,72 והפעלת אפופטוזיס 62. כלים אלה ורבים אחרים מקוטלגים בנוחות ב-OptoBase, משאב אינטרנט לגישות אופטוגנטיקה מולקולרית28. עבור אלה שקיבלו השראה ליצור כלים אופטוגנטיים חדשניים, המשאב כולל גם תיאורים שימושיים של חלבונים מגיבים לאור ששימשו במגוון רחב של אסטרטגיות, כולל חלבונים מגיבים לאור המגיבים לאורכי גל ירוקים, אדומים ואינפרא אדום קרוב. אנו נרגשים עבור הקהילה המדעית לממש את מלוא הפוטנציאל של גישות אופטוגנטיות מולקולריות.

מסלולי איתות מאפשרים לתאים להגיב לסביבתם ולתאם פעילויות בקנה מידה של רקמות ואורגניזמים. אותות חיוניים להתפתחות עוברית כוללים את חברי משפחת TGF-beta חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) ו- Nodal 1,2,3. במהלך האמבריוגנזה, המסלולים המווסתים על ידי אותות אלה ואחרים מעצבים את תוכנית הגוף על ידי שליטה בביטוי גנים ותהליכים נוספים כדי להבטיח שרקמות ואיברים מגוונים יתפתחו ויתממשקו כראוי. פתולוגיות, כולל מומים מולדים וסרטן, יכולות להתרחש כאשר איתות או תגובות לאיתות מוטרדים 4,5,6,7. למרות חקירה קפדנית של אותות, נותר לגלות הרבה יותר על האופן שבו רמות ודינמיקה מפוענחות במגוון הקשרים 8,9,10,11, במיוחד במהלך פיתוח 12,13,14,15,16,17,18,19.
כדי להבין כיצד מפוענח איתות, ניסוי אידיאלי יהיה לתפעל את רמות האיתות, התזמון ו / או הדינמיקה - עם רמה גבוהה של שליטה מרחבית וזמנית - ולהעריך את התוצאות. לדוגמה, שיפועי איתות מרחביים מדויקים מוצעים לתבניות מתפתחותרקמות 20,21. שינוי ההתפלגויות המרחביות של שיפוע האיתות יסייע לבחון השערה זו22. בנוסף, חשיבותה של דינמיקת איתות ביצירת תגובות תאיות מגוונות הולכת ומתבהרת: אותו מסלול איתות יכול להורות לתאים להתמיין או להתרבות בהתאם לתדירות האיתות, למשל 9,23. פרדיגמות ניסיוניות שבהן ניתן לתפעל בקלות דינמיקת איתות יהיו בעלות ערך כדי לחקור את הקשר בין דינמיקה והחלטות גורל התא 8,12,13,14,15.
מבחינה היסטורית, שיטות רבות שימשו למניפולציה של איתות בהקשרים התפתחותיים, מה שהוביל לתגליות בסיסיות 1,2,3. ניתן לחסום איתות באמצעות מוטציות של אובדן תפקוד, ביטוי מעכב חוץ רחמי או תרופות אנטגוניסטיות. שיטות להפעלת איתות כוללות תרופות אגוניסטיות, ליגנדות רקומביננטיות, ביטוי חוץ רחמי של ליגנדות או קולטנים פעילים באופן קונסטיטוטיבי, ומוטציות של אובדן תפקוד של מעכבי מסלול. שיטות אלה נעות לאורך רצף של בקרה ניסיונית. לדוגמה, מוטנטים וביטוי חוץ רחמי עשויים ליפול בצד הפטיש של הרצף: בגישות אלה, שינויים דרמטיים ומערכתיים בפעילות המסלול עלולים לגרום למוות מוקדם ולמנוע חקירות בשלבים מאוחרים יותר, או לאורך זמן עלולים לגרום להשפעות פליוטרופיות שקשה להתיר אותן. בנוסף, לעתים קרובות מאתגר לתפעל באופן עצמאי תכונת איתות אחת בכל פעם, כגון רמה או משך. לקראת הקצה השני של הרצף, שיטות מסוימות מציעות בקרה ניסיונית מדויקת יותר, כגון התקנים מיקרופלואידים החושפים דגימות לתרופות או חלבונים רקומביננטיים עם בקרה טמפורלית ולעתים מרחבית 18,24,25, או שיטות גנטיות, כולל מקדמי הלם חום וספציפיים לרקמות שיכולים להציע יתרונות דומים16,26,27. עם זאת, שיטות אלה עשויות להיות קשות לביצוע, עשויות להיות בלתי הפיכות, עשויות להיות בעלות קינטיקה איטית יחסית או רזולוציה ירודה, ועשויות להיות בלתי זמינות במערכות מודל מסוימות.
גישות אופטוגנטיות מולקולריות הן תוספת רבת עוצמה לארגז כלים זה. גישות אלה משתמשות בחלבונים המגיבים לאורכי גל שונים של אור כדי לתמרן תהליכים ביולוגיים, כולל איתות 8,12,13,14,15, ופותחו במשך עשרות שנים לשימוש במגוון מערכות מתרבית תאים ועד בעלי חיים שלמים 12,13,28. בהשוואה לגישות היסטוריות, אופטוגנטיקה מולקולרית יכולה לעתים קרובות להציע רמה גבוהה יותר של שליטה מרחבית-זמנית על תהליכים ביולוגיים: הבקר במערכות אופטוגנטיות הוא קל, והשליטה באורך הגל של האור, בעוצמתו, במשך הזמן ובתדירות החשיפה פשוטה יחסית. עם מערכות מתוחכמות כגון מיקרוסקופים קונפוקליים ושני פוטונים, שליטה מרחבית בתחום התת-תאי אפשרית 29,30,31. כלים למניפולציה אופטוגנטית של איתות פותחו ויושמו במספר מערכות, כולל אלה המתוארים ב- Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 ו- Huang et al.34. לדוגמה, תוך ניצול השליטה המרחבית שמעניקה האופטוגנטיקה, אסטרטגיה זו שימשה לאחרונה לשינוי שיפוע איתות בעוברי דרוזופילה, והראתה כי אמבריוגנזה של זבובים עמידה באופן מפתיע לשינויים בשיפועזה 22. ההפיכות והקינטיקה המהירה/כבויה של מפעילי איתות אופטוגנטי הפכו אותם גם לכלים אטרקטיביים לחקר פענוח דינמיקת איתות 8,12,13,14,15,34,35,36.
העובר המוקדם של דג הזברה הוא מערכת in vivo המתאימה היטב למחקרים אופטוגנטיים מכיוון שהיא מופרית חיצונית, שקופה, ידידותית למיקרוסקופיה וניתנת למשיכה גנטית. קל יותר להעביר חשיפה לאור לעוברים המתפתחים מחוץ לאם, אור יכול לחדור ולגשת לרקמות הלא אטומות שלהם, עוברים חיים של דגי זברה סובלים היטב הדמיה (בנוסף להיותם שקופים), ושיטות גנטיות קיימות מספקות הזדמנויות פשוטות לניסויי הפלה וביטוי יתר, בנוסף לפיתוח טרנסגניות שימושיות37.
לאחרונה פותחו כלים אופטוגנטיים להפעלת איתות BMP38 ו-Nodal39 בעוברים של דגי זברה עם חשיפה לאור כחול (איור 1). אנו מתייחסים לכלים אלה כאל bOpto-BMP ו-bOpto-Nodal (b עבור אור כחול מופעל ו-Opto עבור אופטוגנטיקה). bOpto-BMP/Nodal מבוססים על מנגנוני הפעלת מסלולים דומים. הקישור של ליגנדות BMP או Nodal לקולטן המתאים שלהן serine-threonine kinases מניע אינטראקציות בתחום הקולטן קינאז המובילות לזרחון של אפקטי איתות (Smad1/5/9 עבור BMP ו- Smad2/3 עבור Nodal). לאחר מכן, גורמי איתות זרחניים עוברים טרנסלוקציה לגרעין ומווסתים את ביטוי גן המטרה3 (איור 1A,D). אינטראקציות קולטן קינאז אלה יכולות להיות תגובתיות לאור על-ידי צימוד קינאזות קולטן לחלבונים מתערבלים המגיבים לאור: עם חשיפה לאור, החלבונים הכימריים האלה אמורים להתעמעם, מה שגורם לתחומי הקולטן קינאז לקיים אינטראקציה ולהפעיל איתות (איור 1B,C,E,F). חשוב לציין, בניגוד לקולטנים אנדוגניים, bOpto-BMP/Nodal אינם מכילים תחומים קושרי ליגנדים חוץ-תאיים, מה שמבטיח פעילות בלתי תלויה בליגנד (איור 1C,F). אסטרטגיית הפעלה אופטוגנטית זו הושגה לראשונה עם קולטן טירוזין קינאזות40,41,42 ולאחר מכן יושמה על קולטן סרין-תראונין קינאזות.
bOpto-BMP/Nodal משתמש בתחום חישת אור-חמצן-מתח הומודימריזציה (LOV) המגיב לאור כחול (~450 ננומטר) מהאצות Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. המבנים האלה מורכבים ממוטיב מיריסטואילציה ממוקד קרום ואחריו תחומי קולטן BMP או Nodal receptor kinase, המאוחים לתחום LOV (איור 1B,E). חשיפה לאור כחול אמורה לגרום להומודימריזציה של LOV, וכתוצאה מכך לאינטראקציות בתחום הקולטן קינאז שיובילו לזרחן Smad ולהפעלת מסלול בהתאמה (איור 1C,F). עבור bOpto-BMP, נמצא כי שילוב של מבנים עם תחומי קולטן קינאז מסוג I מ-Acvr1l (הידוע גם בשם Alk8) ו-BMPR1aa (הידוע גם בשם Alk3) ותחום קולטן קינאז מסוג II מ-BMPR2a מפעיל בצורה אופטימלית איתות38 (Addgene #207614, #207615 ו-#207616). עבור bOpto-Nodal, שילוב של מבנים עם תחום קולטן קינאז מסוג I מ- Acvr1ba ותחום קולטן קינאז מסוג II מ- Acvr2ba משמש39.
bOpto-BMP/Nodal הוכנסו לעוברים מוקדמים של דגי זברה על ידי הזרקת mRNA בשלב התא האחד, ושימשו לחקר תפקיד משך האיתות בפירוש Nodal39, כדי לקבוע מדוע דגי זברה מאבדים את היכולת להגיב ל-Nodal45, וכדי לבחון כיצד גני המטרה של BMP מגיבים לרמות איתות BMP שונות38. סביר להניח כי כלים אלה ימשיכו להיות שימושיים במגוון רחב של חקירות עתידיות. עם זאת, כוחם של מפעילי איתות אופטוגנטי הוא גם חולשתם: דגימות רגישות לאור חייבות להיות מטופלות בזהירות כדי למנוע פעילות איתות חוץ רחמי בשוגג. חשיפה לאור החדר או לאור השמש יכולה להפעיל bOpto-BMP/Nodal.
פרוטוקול זה מספק הצעות מעשיות לשימוש במפעילי BMP ו-Nodal מבוססי LOV מקודדי mRNA בעוברים מוקדמים של דגי זברה. הוא מתחיל בפירוט אסטרטגיה אחת לבניית קופסת אור לבקרת חשיפה וטמפרטורה אחידות לאור (איור 2, קובץ משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4, קובץ משלים 5, קובץ משלים 6, קובץ משלים 7, קובץ משלים 8). לאחר מכן הוא מתאר שני ניסויי בקרה מרכזיים שקובעים אם מפעיל איתות אופטוגנטי מתנהג כצפוי – כלומר, מפעיל פעילות מסלול רק כאשר הוא נחשף לאור (איור 3). בדיקת הבקרה הראשונה כוללת בחינת פנוטיפים יום אחד לאחר ההפריה בעוברים שנחשפו לאור ולא נחשפו (איור 3A). עוברים שנחשפו לאור בהזרקת mRNA, אך לא עוברים שלא נחשפו, צריכים להיות בעלי ביטוי יתר של BMP או Nodal (איור 4A,B; פנוטיפים BMP בפרט ניתנים להבחנה ברורה בנקודת זמן זו46). בדיקה זו מספקת קריאת פעילות מהירה. במבחן הבקרה השני, כדי לקבוע אם פנוטיפים נגרמים באופן ספציפי על ידי עודף BMP או איתות Nodal וכדי לצפות ישירות בשינוי ברמות האיתות, צביעה אימונופלואורסצנטית משמשת לזיהוי אפקטי איתות זרחניים (pSmad1/5/9 או pSmad2/3, בהתאמה) לאחר חשיפה לאור של 20 דקות סביב שלב הבלסטולה המאוחרת / הגסטרולציה המוקדמת, כאשר פעילות האיתות תוארה היטב12, 16,17,47,48,49,50 (איור 3B ואיור 4C). (שים לב שלמרות שהפעלה מקומית מרחבית הודגמה הן עבור bOpto-BMP38 והן עבור bOpto-Nodal39, פרוטוקול זה מתאר רק חשיפה אחידה לאור ואסטרטגיות הפעלת איתות.) מומלץ לבצע ניסויי בקרה אלה לפני החלת bOpto-BMP/Nodal על שאלות מחקר ספציפיות על מנת לקבוע תנאי ניסוי מקומיים אידיאליים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

מסלולי איתות מתזמרים תהליכים ביולוגיים בסיסיים, כולל התפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. שיטות למניפולציה ניסיונית של איתות נדרשות כדי להבין כיצד איתות מתפרש בהקשרים רחבים אלה. כלים אופטוגנטיים מולקולריים יכולים לספק מניפולציות הפיכות של פעילות מסלול איתות עם רמה גבוהה של שליטה מרחבית-טמפורלית ויושמו במבחנה, ex vivo ו-in vivo. כלים אלה משלבים תחומים חלבוניים מגיבי אור, כגון תחום חישת אור-חמצן-מתח (LOV) של אור כחול, עם אפקטי איתות כדי להעניק שליטה ניסיונית תלוית אור על איתות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש בחלבון מורפוגנטי עצם מבוסס LOV (BMP) ומפעילי איתות Nodal bOpto-BMP ו- bOpto-Nodal בעובר הנגיש אופטית של דגי זברה. הוא מתאר שני ניסויי בקרה: בדיקת פנוטיפ מהירה לקביעת תנאי ניסוי מתאימים, ובדיקת אימונופלואורסצנטיות להערכה ישירה של איתות. יחד, ניסויי בקרה אלה יכולים לסייע בהקמת צינור לשימוש בכלים אופטוגנטיים בעוברים מוקדמים של דגי זברה. אסטרטגיות אלה מספקות פלטפורמה רבת עוצמה לחקור את תפקידי האיתות בהתפתחות, בריאות ופיזיולוגיה.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

מחבר זרקור: מניפולציה איתות בעוברים של דגי זברה כדי לפענח החלטות גורל התא 

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

המטרה של שני ניסויי הבקרה המתוארים כאן היא לקבוע אם bOpto-BMP/Nodal מפעילים את המסלולים שלהם בהתאמה בתגובה לחשיפה לאור כחול מבלי להשפיע על איתות בהיעדר אור, כצפוי. השתמש בפקדים אלה כדי לקבוע את זרימת העבודה הניסיונית המתאימה במעבדה שלך לפני החלת bOpto-BMP/Nodal על שאלות המחקר המעניינות אותך.
בדיקת הפנוטיפ יכולה להסתיים תוך יומיים בלבד, והיא מספקת אינדיקציה שימושית לפעילות איתות ופוטוטוקסיות (איור 3A). עוברים מוזרקים, חשופים לאור כחול צריכים פנוסקופיה עודף איתות BMP (ventralization46; איור 4A, פאנל שמאלי) או איתות נודאלי (פגמים התפתחותיים הקשורים למזנדודרם נוסף 1,3,47,57,58,59,60 (איור 4A, פאנל ימני)). אם מוזרקים, עוברים שנחשפו לאור הם אפנוטיפיים, בדקו את איכות ה-mRNA ושקלו להזריק יותר, ובדקו שוב את אסטרטגיית החשיפה לאור כדי להבטיח חשיפה קבועה לאור בהיר (~450 ננומטר אור עם קרינה של 45 W/m2 אמור להפעיל איתות חזק). לעומת זאת, עוברים מוזרקים ולא חשופים צריכים להיראות זהים לאחים שאינם מוזרקים. אם מוזרקים, עוברים שלא נחשפו מציגים פנוטיפים, מפחיתים את כמות ה-mRNA המוזרק ומעריכים מחדש את מערך הניסוי כדי להבטיח שעוברים שלא נחשפו מוגנים מפני חשיפה לאור. הנתונים המוצגים באיור 4B מראים תוצאות מניסויי פנוטיפ טיפוסיים עם כמויות mRNA מתאימות ותנאי חשיפה: פעילות איתות חזקה ניכרת בעוברים מוזרקים החשופים לאור, כאשר רק חלק קטן מהעוברים המוזרקים והלא חשופים מציגים פנוטיפים.
בדיקת הפנוטיפ מספקת גם הזדמנות להעריך פוטוטוקסיות. אם רעילות האור זניחה, עוברים שאינם מוזרקים וחשופים לאור צריכים להיראות פראיים, בדומה לעוברים שאינם מוזרקים ולא חשופים. אם לעוברים שאינם מוזרקים, חשופים לאור יש פגמים, אך לא עוברים שלא הוזרקו ולא נחשפו, שקול להפחית את קרינת האור. קרינה של 45 W/m2 מפעילה איתות חזק ללא פוטוטוקסיות ברורה. הנתונים המוצגים באיור 4B אינם מראים הבדלים מדאיגים בין עוברים שאינם מוזרקים, חשופים לאור ועוברים שאינם מוזרקים ולא חשופים, מה שמצביע על רעילות אור זניחה.
למרות שמבחני האימונופלואורסצנטיות דורשים יותר זמן ומאמץ (~ 1 שבוע) בהשוואה לבדיקת הפנוטיפ (יומיים), צביעה אימונופלואורסצנטית מספקת קריאה ישירה של פעילות מסלול האיתות ועשויה לחשוף שינויי איתות עדינים שעשויים שלא לבוא לידי ביטוי במורפולוגיה גסה. אימונופלואורסנציה חשובה במיוחד להערכת תגובות ל-bOpto-Nodal, מאחר שאיתות נודאלי עודף גורם לעתים קרובות לעוברים לשכב ב-1 dpf – דבר שיכול להיות בעל סיבות רבות – בניגוד לפנוטיפים הספציפיים של הגחון האופייניים לאיתות BMP עודף46 (איור 4A). עוברים מוזרקים וחשופים לאור כחול צריכים להציג עלייה אחידה בזרחן Smad1/5/9 או Smad2/3 בהשוואה לעוברים שלא הוזרקו ונחשפו לאור. אם הרמות אינן עולות, או רק עולות חלש, בדקו את איכות ה-mRNA ושקלו להזריק יותר, ובדקו שוב את אסטרטגיית החשיפה לאור. חשיפה של 20 דקות לאור כחול עם קרינה של 45 W/m2 סביב 40% epiboly אמורה להפעיל חזק את האיתות. אם צביעת pSmad אינה אחידה, נסו להזריק mRNA למרכז התא (ולא לחלמון), מה שעשוי לגרום לפיזור mRNA אחיד יותר.
עוברים מוזרקים ולא חשופים צריכים להיות בעלי רמות pSmad דומות לעוברים שאינם מוזרקים. באופן אנקדוטלי, ראינו זרחן Smad דולף יותר עם bOpto-Nodal מאשר bOpto-BMP. אם רמות pSmad מוגברות בעוברים מוזרקים ולא חשופים, הפחיתו את כמות ה-mRNA המוזרק. בנוסף, להעריך מחדש את מערך הניסוי כדי להבטיח 1) עוברים שלא נחשפו לאור, 2) חשיפה לאור במהלך הקיבוע היא מינימלית. במהלך שלב הקיבוע, קריטי לאפשר לא יותר מ 45 שניות לחלוף בין הסרה מקופסת האור לטבילה בפורמלין. בנוסף, במהלך שלב זה צמצם את החשיפה לאור החדר ולאור השמש על ידי סגירת תריסי חלונות, כיבוי מקורות אור לבנים, שימוש באור אדום או כיסוי מקורות אור לבנים בנייר מסנן ג'ל חוסם אור כחול (רשימת חומרים).
הנתונים באיור 4C מראים את התוצאות מניסויי צביעה אימונופלואורסצנטיים טיפוסיים עם כמויות mRNA מתאימות ותנאי חשיפה לאור: רמות pSmad דומות בעוברים שלא הוזרקו ולא נחשפו, בעוד שעוברים מוזרקים וחשופים לאור מציגים רמות גבוהות יותר של זרחן Smad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> איור 1: אסטרטגיית הפעלת איתות bOpto-BMP ו-Nodal . (A) מסלול האיתות האנדוגני BMP מופעל על-ידי קשירת ליגנד BMP, מה שמוביל להיווצרות קומפלקס קולטנים מסוג I/II, זרחן של Smad1/5/9 וביטוי של גני מטרה מסוג BMP. קולטני הסוג I BMPR1aa ו- Acvr1l ידועים גם בשם Alk3 ו- Alk8, בהתאמה. BMPR2a הוא קולטן מסוג II. (B) bOpto-BMP בונה38. תחומי קינאז פוטטיביים מ- BMPR1aa ו- Acvr1l מאוחים ל- LOV; היתוך BMPR2a-LOV מכיל את תחום הקינאז המשוער ואת תחום הקולטן C-terminal (CTD). כל האיחויים ממוקדים בקרום עם מוטיב מיריסטואילציה (Myr). הדומיינים מופרדים על ידי מקשרים גליצין-סרין (GS). מבנים מתויגים ב- CTD עם תג אפיטופ HA. שילוב זה של שלושה מבנים נמצא כמפעיל באופן אופטימלי איתות BMP. (C) הפעלת איתות BMP בתיווך bOpto-BMP. כאשר נחשפים לאור כחול, תחומי LOV מתפוגגים, מה שנחשב כמעורר היווצרות מורכבת והפעלת איתות. (D) מסלול האיתות הנודאלי האנדוגני מופעל על ידי קשירת ליגנד נודאלי, מה שמוביל להיווצרות קומפלקס קולטנים מסוג I/II, זרחן של Smad2/3 וביטוי של גני מטרה נודליים. קולטן מסוג I Acvr1ba וקולטן מסוג II Acvr2ba ידועים גם בשם Acvr1b ו- Acvr2b, בהתאמה. (E) bOpto-Nodal מבנים39. דומיינים של קינאז פוטטיבי מ-Acvr1ba ו-Acvr2ba מאוחים ל-LOV. כל האיחויים ממוקדים בקרום עם מוטיב מיריסטואילציה (Myr). דומיינים מופרדים על ידי מקשרי GS. מבנים מתויגים ב- CTD עם תג אפיטופ HA. (F) הפעלת איתות Nodal בתיווך bOpto-Nodal. כאשר נחשפים לאור כחול, תחומי LOV מתפוגגים, מה שנחשב כמעורר היווצרות מורכבת והפעלת איתות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> איור 2: קופסת אור מבוקרת טמפרטורה לניסויים אופטוגנטיים . (A) תאורת מיקרו-פלטת LED מותקנת בראש האינקובטור באמצעות מחזיק LED שנבנה בהתאמה אישית. עוברים של דגי זברה בצלחת בת 6 בארות על המדף הראשון נחשפים לאור דרך חור שנקדח בחלק העליון של האינקובטור. המדף התחתון מכיל קבוצה שנייה של עוברי ביקורת לא חשופים בצלחת 6 בארות עטופה ברדיד אלומיניום. דלת האינקובטור מרופדת בהפשטת מזג אוויר כדי למנוע חשיפה לא מכוונת לאור החדר או לאור השמש. (ב) פירוט ההליך ליצירת חור באינקובטור באמצעות מקדח שלבים. במודל החממה הנהוג כאן יש פאנל פנימי שדרש קידוח חור שני, גדול יותר (Table of Materials). (C) פירוט מחזיק ה-LED המותאם אישית המיועד למערכת תאורה בשלושה אורכי גל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> איור 3: זרימת עבודה של ניסוי bOpto-BMP/Nodal. בדיקת פנוטיפ וצביעה אימונופלואורסצנטית pSmad לבדיקת פעילות bOpto-BMP/Nodal. עוברים מוזרקים עם mRNA בשלב התא האחד ומועברים לתיבת אור לא יאוחר מ 1.5 שעות לאחר ההפריה (hpf). (A) בדיקת פנוטייפ. עוברים מוזרקים ואחים שאינם מוזרקים גדלים בחושך או נחשפים לאור כחול אחיד החל מ- 1.5 HPF ועד יום אחד לאחר ההפריה (DPF). ניתן להעריך את פעילות האיתות האופטוגנטי על ידי ניקוד עוברים עבור פנוטיפים התואמים לפעילות מסלול עודפת. (B) צביעת pSmad immunofluorescence. עוברים מוזרקים ואחים שאינם מוזרקים גדלים בחושך עד 40% אפיבולי (~ 6 hpf). מחצית מהעוברים המוזרקים וחצי מהעוברים שאינם מוזרקים נחשפים לאור כחול אחיד למשך 20 דקות. לאחר החשיפה, כל העוברים קבועים ונתונים לכתמים אימונופלואורסצנטיים עבור pSmad. רמות גבוהות של pSmad1/5/9 או pSmad2/3 משקפות הפעלה אופטוגנטית של איתות BMP או Nodal, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> איור 4: הערכת תגובות איתות המופעלות באמצעות אור בעוברים של דגי זברה. לעוברים של דגי זברה הוזרקו בשלב התא האחד mRNA המקודד bOpto-BMP/Nodal. (A) העוברים גודלו בחושך או נחשפו לאור כחול אחיד החל משעה וחצי לאחר ההפריה (HPF). פנוטיפים הובקעו ביום אחד לאחר ההפריה (dpf). מוצגים פנוטיפים מייצגים. איתות BMP עודף מוביל לגחון (פאנל שמאלי), בעוד איתות נודאלי עודף גורם לפגמים התפתחותיים הקשורים למזנדודרם נוסף (פאנל ימני). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) כימות פנוטייפ. עוברים מוזרקים ואחים שלא הוזרקו גודלו בחושך החל מ-1.5 HPF (נורה שחורה). מחצית מהעוברים שהוזרקו ומחצית מהעוברים שלא הוזרקו נחשפו לאור כחול אחיד (נורה כחולה). (C) עוברים מוזרקים ואחים שלא הוזרקו גודלו בחושך החל מ-1.5 HPF (נורה שחורה). ב-40% אפיבולי (~6 hpf), מחצית מהעוברים שהוזרקו ומחצית מהעוברים שלא הוזרקו נחשפו לאור כחול אחיד (נורה כחולה). לאחר 20 דקות, כל העוברים תוקנו ועברו צביעה אימונופלואורסצנטית עבור Smad1/5/9 זרחני או Smad2/3. עוצמות pSmad גבוהות יותר מצביעות על איתות BMP/Nodal מוגבר, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: הרכבה מלאה של קופסת אור. קובץ PDF תלת-ממדי המציג תצוגה תלת-ממדית של מכלול תיבת האור המלאה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: תצוגת תיבת אור מפוצצת. קובץ PDF תלת-ממדי המציג תצוגה תלת-ממדית של מכלול קופסת האור שהתפוצצה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: אטם קל גדול. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור אטם האור הגדול עבור מחזיק ה- LED באמצעות חותך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: אטם קל קטן. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור אטם האור הקטן עבור מחזיק ה- LED באמצעות חותך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 5: בסיס פלטפורמה אקרילית. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור בסיס פלטפורמה אקרילי מחזיק LED באמצעות חותך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 6: פלטפורמה אקרילית אנכית. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) לייצור מחזיק LED פלטפורמה אקרילית אנכית באמצעות חותך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 7: תמיכה אקרילית משמאל. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) כדי לייצר את מחזיק ה- LED תמיכה אקרילית שמאלית באמצעות חותך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 8: זכות תמיכה אקרילית. קובץ שרטוט CAD (. פורמט DWG) כדי לייצר את מחזיק ה- LED תמיכה ימנית אקרילית באמצעות חותך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions at JoVE.com

מניפולציה אופטוגנטית של מסלולי איתות יכולה להיות אסטרטגיה רבת עוצמה לחקור כיצד איתות מפוענח בהתפתחות, התחדשות, הומאוסטזיס ומחלות. פרוטוקול זה מספק הנחיות מעשיות לשימוש במפעילי איתות מסוג Nodal וחלבון מורפוגני עצם (BMP) מבוססי חישת אור-חמצן בעובר המוקדם של דגי הזברה.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

כדי לקבוע את תוכנית הגוף של העובר במהלך ההתפתחות, תאים נחשבים לפענח עוצמות איתות, דינמיקה ושילובים. אנו משתמשים באופטוגנטיקה כדי לתפעל את תכונות האיתות האלה בעוברים של דגי זברה. גישה זו תעזור לנו להבין כיצד תאים עובריים מפענחים איתות כדי לקבל כמה מההחלטות הסולפטיות-מוקדמות ביותר הגישות האופטוגנטיות שנדונו כאן משתמשות באור כשלט רחוק כדי להפעיל איתות BMP או nodal במהירות והפיך.מכיוון שקל לכוון את החשיפה לאור, גישות אלה יכולות להציע שליטה ניסיונית משופרת באיתות. הפרוטוקול שלנו מציג שימוש בכלים רגישים לאור אלה בעוברים של דגי זברה. עם שליטה זמנית ומרחבית משופרת זו, כעת ניתן יהיה לבצע שינויי איתות מדויקים במהלך פיתוחים של דגי זברה.אנו מצפים שזה יעמיק את ההבנה שלנו לגבי האופן שבו תאים מפענחים איתות כדי לקבל החלטות חלשות, מה שיעזור לגלות כיצד מתפתחת תוכנית הגוף העוברי.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K Views.  NIH. כדי לקבוע את תוכנית הגוף של העובר במהלך ההתפתחות, תאים נחשבים לפענח עוצמות איתות, דינמיקה ושילובים. אנו משתמשים באופטוגנטיקה כדי לתפעל את תכונות האיתות האלה בעוברים של דגי זברה. גישה זו תעזור לנו להבין כיצד תאים עובריים מפענחים איתות כדי לקבל כמה מההחלטות הסולפטיות-מוקדמו?...

Video: מחבר זרקור: מניפולציה איתות בעוברים של דגי זברה כדי לפענח החלטות גורל התא 

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Injecting bOpto-BMP&#47;Nodal Constructs into Zebrafish Embryos 

Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos   

To begin, use an incubator and an LED Microplate Illuminator to create a light box for controlling light exposure and temperature. Then, position a six well plate on the upper shelf of the incubator, and check whether the light beam evenly encompasses it. Use a sheet of paper to visualize the distribution of light coverage.Use a light meter to measure irradiance and spatial uniformity. At least one day before injections, make injection dishes and agarose-coated six well plates. Rinse an injection dish mold with embryo medium, and place gently onto molt and agarose.Once the agarose has solidified, delicately use the tab to remove the mold. Next, prepare flamed glass pipettes for immunofluorescence experiments on dechlorinated embryos. Place the end of a glass pipette into a bun and burner flame, and rotate continuously until the edges become smooth.Prepare an injection mix using the mRNAs shown here. For the phenotyping assay, introduce the needle through the corion directly into the center of the cell at the one cell stage, and inject one nanoliter of the injection mix. If conducting an immunofluorescence assay, target the center of the cell of coated embryos at the one cell stage.For both assays, prepare enough embryos for the unexposed non-injected, unexposed injected, exposed non-injected, and exposed injected embryos. Select at least 30 embryos per condition. For the immunofluorescence assay, prepare an additional dish containing non-injected embryos as a proxy to assess the progression of developmental stages.After injection, incubate the embryos in Petri dishes at 28 degrees Celsius.

הזרקת מבנים bOpto-BMP/nodal לעוברים של דגי זברה 

Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

To begin, incubate the injected zebrafish embryos at 28 degrees Celsius. Around 1.5 HPF at the four to 16 cell stage, remove unfertilized and unhealthy embryos. For the phenotyping assay, wrap the unexposed control plate with noninjected and injected embryos in aluminum foil.Position the foil covered plate on the lower shelf, and the exposed plate on the upper shelf of the 28 degrees Celsius light box. After confirming that the dish cover is in place, activate the blue light, and shut the light box door to prevent unintended room light exposure. For the immunofluorescence assay around 1.5 HPF, individually wrap the exposed and unexposed dishes in aluminum foil while keeping the proxy dish unwrapped.Put all the dishes in the 28 degrees Celsius light box without activating the LED. Close the light box door to prevent inadvertent exposure to room light. At approximately five HPF, use a dissecting scope to evaluate the developmental stage of the proxy embryos.Also remove the wrapped dishes to ensure uniform temperature exposure across all dishes. Once the proxy embryos reach 40%epiboly, uncover the exposed dish and place it on the upper shelf of the light box. Keep the unexposed dish covered on the lower shelf.Immediately activate the blue light, close the door, and set a timer for 20 minutes. To prepare for fixation, eliminate as much room light as possible. Just before fixation, take tubes containing 4%formaldehyde from four degrees Celsius and position them beside the light box.After 20 minutes, open the door of the light box and remove the dish that wasn't exposed to light. Use a flamed glass pipette tip to remove the light sensitive embryos from the dish. Then to immerse the embryos in 4%formaldehyde, submerge the flamed glass pipette tip in the formaldehyde, and allow the embryos to sink into the liquid.Store fixed embryos at four degrees Celsius overnight.

ניסוי חשיפה לאור להפעלת איתות BMP או Nodal בדגי זברה

Evaluation of bOpto-BMP&#47;Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment  

For the phenotyping assay, perform the light exposure experiment on bOpto-BMP bOpto-Nodal expressing zebrafish embryos, and remove them from the light box at one day post-fertilization between 24 to 32 HPF. Using a dissecting scope, evaluate phenotypes and establish a scoring rubric. Assess embryos while they remain within the chorion for convenience.Utilize a pipette to probe to reposition embryos for viewing from different angles. For the immunofluorescence assay, after incubating embryos in 4%formaldehyde at four degrees Celsius overnight, remove the formaldehyde and rinse them three to five times with PBST. Discard the PBST and add 100%methanol.Seal the tubes and gently invert them to mix residual PBST and methanol. After washing the embryos two more times with methanol, store them at minus 20 degrees Celsius for at least two hours up to several years. Using a microscope equipped for optical sectioning, capture images of immunostained embryos.Immunofluorescent staining experiments with appropriate mRNA amounts and light exposure conditions showed that the pSmad levels were similar and non-injected in unexposed embryos, whereas injected light exposed embryos exhibited higher levels of Smad phosphorylation.