אנו מודים פומי קובל טוד Thiele וHerwigBaier (קליפורניה / מקס פלנק) עצה על ניסויי התנהגות וDPSS הליזר הקים; Heesoo קים וקיארה Cerri מקורס נוירוביולוגיה MBL לסיוע בניסויי השף tdTomato; PetronellaKettunen (אוניברסיטת גטבורג ) לשיתוף פעולה ראשוני על ניסויי optogenetic; BaljitKhakh, אריק הדסון, מייק Baca וג&#39;ון מיליגן (UCLA) לייעוץ טכני, ורוג&#39;ר צ&#39;היין (UCSD) לשף tdTomato לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי פרס NRSA (5F31NS064817) לAMSP ומענק של NSF (RIG: 0819010) ל-AS.

הכן הבא מבעוד מועד. 1. הכן כבלים אופטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת יחידת אחסון לכבל האופטי על ידי המסת הצוואר המחודד של זכוכית פיפטה פסטר מעל מבער בונזן ליצור ~ 150 מעלות זווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך חוט או סכין גילוח, לחתוך בזהירות את הכבל האופטי לשני חלקים. כל תכשיט צריך להיות קצה אחד עם קצה חשוף FC 1 / מתאם למחשב אישי ו. אחסן חתיכה אחת ככבל מילואים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוף את הכבל האופטי עד לחיפוי על ידי הסרת מעייל הסיבים וסיבי חיזוק (איור 1 א &#39;) מ5.0 סנטימטר של קצה חתוך של הכבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס כבל אופטי לתוך פיפטה פסטר המוכנה. ודא כבל יכול בקלות לעבור ולצאת מקצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כבל אופטי בולט מקצה פסטר פיפטה, לחתוך בזהירות ולהסיר חיפוי סיבים מרחבי סיבי זכוכית, ~ 2 מ&quot;מ מקצה חתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חותך יהלומי עט / זכוכית, ניק סיבי הזכוכית ולשבור off הסוף ליצור חתך / משטח נקי בסופו של הסיב (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בו כבל אופטי לתוך פיפטה פסטר לאחסון. חזור על פעולה (1.6) אם קצה הסיב אופטי מקבל סדוק או הפסקות בצורה לא אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבל אופטי עמדה בפיפטה פסטר באמצעות micromanipulator (התרשים 1C). </li></ol> נהלים 2-8 מתארים שיטה להזרקת transgenes לעוברים בדרך החלימו על דג זברת ניסויים רבים. וריאציות על שיטה זו, כמו אלה המתוארים בסרטונים אחרים יופיטר 6, 7, 8, 9, 22 הן יעילות באותה מידה. 2. משוך מחטי הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש חולץ מחט, למשוך צינורות זכוכית ורוסיליקט לשתי מחטי הזרקה עם קצה מחודד בהדרגה. הגדרות חולץ תשתנינה. (בחולץ מחט מכשירי סאטר להשתמש בהגדרות: P = 500, חום = 720, משוך = 50, מהירות = 70 וזמן = 150). כל חולץ מחט הוא שונה, כדי לייעל את חולצם הגדרותpirically. למחטים מחודדות יותר, להגביר את החום ו / או משוך. למחטים פחות מחודדות, להגדיל את הזמן ו / או למשוך את הירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחטים שומרות בכלי מאובטח (כלומר צלחת פטרי עם קלטת התגלגלה, את הצד דבק). </li></ol> 3. יוצק תבניות להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממסים 0.5 גרם agarose בעובר מ&quot;ל 30 / מים כחולים, עד agarose נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצק לתוך החצי תחתון של צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עובש מלבני עם הרכבת בארות (איור 2) לagarose, נזהר להגביל היווצרות בועה סביב הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עובש ולמלא צלחת פטרי עם צבע כחול / מי עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן זקוף, מלא במים נקיים, בטמפ &#39;חדר לאותו יום או שימוש ב 4 ° C לשימוש עתידי. </li></ol> 4. הפוך Mix-DNA פלסמיד לזריקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל DNA פלסמיד לריכוז של 50 ng / μl באדום פנול 1:10 בDDH 2 O. עבורדוגמה: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1.0 מ&quot;ל </td><td> DNA פלסמיד (250 ng / ml) </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> פנול אדום </td></tr><tr><td> 3.5 מ&quot;ל </td><td> DDH 2 O </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמהיל DNA יכול להישמר בטמפרטורת חדר, אם להשתמש מייד או מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. </li></ol> 5. הגדרת צמדי הזדווגות זה צריך להיעשות בערב לפני שאתה מתכנן לעשות זריקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא טנקי רבייה במי מערכת ומקום דג זכר ונקבה ביחד. אם זריקות לא ניתן לבצע בהקדם להדליק אורות במתקן, דגי זכר ונקבה נפרדים עם מחיצה. </li></ol> 6. היכון לזריקות (ניתן לעשות זאת בזמן המתנה לעוברים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל לחץ מזרק אסדה. ודא שהמערכת מוגדרת לדופק. התחל עם סט משך הפעימה ל1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סתום האוויר ולהתאים ללחוץ מזרק ל~ 20 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ביתור בהגדלה הגבוהה ביותר, לשבור קצה המחט עם מלקחיים או פוקר כדי ליצור ~ פתיחת 2 מיקרומטר (איור 3, סרט 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מחטים בתערובת ה-DNA על ידי: 1. צבת המחט, הצד עד הקצה, לתערובת ה-DNA ומניח את המחט על ידי פעולת נימים למלא או 2. שימוש בטיפ ארוך להגיע לפיפטה 1-2 μl של דנ&quot;א לערבב ישירות לתוך המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מלא מחט במקום בטוח עד מוכן להזרקה. </li></ol> 7. לאסוף עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כיבוי אורות מתקן הפעילו, להסיר מחיצות (אם קיימים). לאסוף עוברים עם מסננת / מסננת קטנה ולהעבירם לצלחת פטרי עם כחול טריים / מי עובר. </li></ol> 8. הזרק עוברים בשלב התא 1-2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים נקטפו לתבניות להזרקה באמצעות פיפטה פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, דחף בעדינות לתוך עובריםבארות עם מלקחיים או פוקר בוטה (איור 4, סרט 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מחט טעונה אל micromanipulator ועמדה על עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול נפח הזרקה באמצעות התאמת משך הפעימה במרווחי 1-צעד עד להשגת הנפח הרצוי (~ 1 NL). זה יכול להיות מכויל עם שקופית מיקרומטר, כמתואר בסרטונים קודמים יופיטר 8, 22, אבל לדיוק ניסוי זה אינו הכרחי, שכן מגוון רחב של נפחי הזרקה יגרום לביטוי הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק ~ 1 nl DNA לערבב ישירות לתוך התא וחזור לכל העוברים. ה-DNA יכולה להיות גם מוזרקת לתוך החלמון, אבל זה נוטה להיות פחות יעיל (איור 5, סרט 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עוברים הזריקו מעובש באמצעות זרם עדין של כחול / מי עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החנות הזריקה עוברים ב28.5 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מופרים, עוברים פגומים או מתים מעת לעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את העוברים wiה PTU בין 18-24 hpf כדי למנוע פיגמנטציה. </li></ol> 9. מסך לביטוי transgene <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24-48 עוברי hpf ידני dechorionate באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם זחלים באמצעות 0.02% tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון, לזהות זחלים עם RB או ביטוי נוירון trigeminal ולהעביר אותם לצלחת חדשה עם מים טריים PTU כחול / עובר. עוברים בעלי ביטוי דליל בתאים קלים לזיהוי הם אופטימליים, אבל נוירונים בודדים יהיו ממוקדים להפעלה עם כבל סיב אופטי כך מגוון רחב של צפיפות ביטוי מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי חנות ב28.5 מעלות צלזיוס בחושך עד שלב ניסיוני רצוי. </li></ol> 10. הר זחלים לניסויים בהתנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך להמס agarose 1.5% נמוכים בDDH 2 O וחנות ב° C בלוק 42 חום כדי למנוע ממנה להתגבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזכוכית פסטר פיפטה, העברה אחד מהזחלים מראש הוקרנו לאמבטיהדואר של 1.5% להמס agarose הנמוך עם כמים כחולים / עובר קטנים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זחלים בירידה של agarose על צלחת פטרי קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, עד הגבו זחל עמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר agarose בסס, כרת את agarose עם סכין גילוח דק (# 11 אזמל), עוזב טריז של אגר סביב כל הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני חתכים אלכסוניים בכל צד של החלמון, לדאוג שלא כינוי הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את האזור שמסביב לagarose עם עובר / מים כחולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך agarose מהחדק והזנב של הזחל (איור 6). </li></ol> 11. הכן את המצלמה במהירות גבוהה ותוכנת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מצלמה במהירות גבוהה על ביתור היקף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המצלמה למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המצלמה במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וידאו / הדמית תוכנה פתוחה (אנו משתמשים בתוכנת הדמית AOS ונתאר נהלים לשימוש בו כאן, אבל הדמיה אחרתתוכנה היא באותה מידה מקובלת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את גדרות מצלמה בהתאם (1000 מסגרות לשנייה (כלומר fps), חיץ הדק 50% או הגדרות מועדפות אחרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בהקלטה. </li></ol> 12. הפעל נוירונים בודדים באמצעות ליזר ננומטר 473 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף ממריץ, ליזר וכבלים אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ממריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר ממריץ למקסימום של 5 וולט ומשך פעימה של 5 אלפיות שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ליזר בהתאם להוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ לנתח כדי למקם את קצה הכבל האופטי בקרבת גוף תא של נוירון עם השף tdTomato ביטוי (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק דופק של אור הכחול להפעלת הנוירון חושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות הקלטה באמצעות מצלמה מהירה ביותר שנקבעה ב500 או 1,000 מסגרות לשנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ניסוי כרצוי, מחכה 1 דקות בין כל הפעלה, כדי למנוע התרגלות. (אנו רושמים את המינימום של שלוש תשובות לכל נוירון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלזחלי שחרור, לחטט בנפרד agarose עם מלקחיים, נזהר שלא לפגוע בבעלי החיים. חיה זו יכולה להיות מותרת להמשיך לפתח וההליך ניתן לחזור בשלב מבוגר לאפיין התפתחות של ההתנהגות. העובר יכול להיות גם שב ועלה להדמית confocal ברזולוציה גבוהה של התא הפעיל, כדי לקשר בין התנהגות עם מבנה תאי, כפי שיתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זחל לצלחת עם התרבות כחולה טריים / מי עובר. אנו משתמשים בצלחת 24 גם כדי לעקוב אחר זחלי פרט. </li></ol> 13. תמונת Neuron (הים) עם confocal מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם זחלים עם 0.02% tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי הר, צד גב למעלה, ב1.2% להמס agarose הנמוך או בעובש הגבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוירונים תמונת השף tdTomato עם ליזר ננומטר 543 ומסנן ואובייקטיבי מתאים. אנו משתמשים 20x אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זחלים מagarose ולחזור לבודדים היטב עם כחול / מי עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב 28.5 מעלות צלזיוס בחושך לפוניתוח rther. </li></ol>

<ol>
	<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin.">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li><li>Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+startle+responses+and+disrupted+left-right+co-ordination+of+motor+behaviors+in+robo3+mutant+zebrafish.">Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish.</a> Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).</li><li>Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+elicited+by+single,+channelrhodopsin-2-evoked+spikes+in+zebrafish+somatosensory+neurons.">Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons.</a> Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).</li><li>Downes, G. B., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraspinal+input+is+dispensable+to+generate+glycine-mediated+locomotive+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).</li><li>Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+locomotor+network+in+zebrafish.">Development of the locomotor network in zebrafish.</a> Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Chimeric+Zebrafish+Embryos+by+Transplantation.">Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).</li><li>Kohashi, T., Oda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+Mauthner-+or+non-Mauthner-mediated+fast+escape+evoked+by+different+modes+of+sensory+input.">Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input.</a> J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).</li><li>Lai, S. L., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mosaic+with+dual+binary+transcriptional+systems+in+Drosophila.">Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila.</a> Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).</li><li>Liao, J. C., Haehnel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+afferent+neurons+in+larval+zebrafish+provides+a+functional+framework+for+lateral+line+somatotopy.">Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy.</a> J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).</li><li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics.">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li><li>Liu, K. S., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+ablations+reveal+functional+relationships+of+segmental+hindbrain+neurons+in+zebrafish.">Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish.</a> Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).</li><li>Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+startle+motor+patterns+and+behaviors+in+the+larval+zebrafish+(Danio+rerio).">Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio).</a> J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).</li><li>Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+transgenic+reporters+identify+somatosensory+neuron+subtypes+in+larval+zebrafish.">New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. , (2012).</li><li>Pujol-Mart&#237;, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., L&#243;pez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+birth+order+identifies+a+dimorphic+sensorineural+map.">Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map.</a> J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li><li>Szobota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Uemura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+functional+genomics+revealed+conservation+and+diversification+of+three+enhancers+of+the+isl1+gene+for+motor+and+sensory+neuron-specific+expression.">Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression.</a> Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).</li><li>Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+dissection+of+a+behavioural+module+in+the+vertebrate+spinal+cord.">Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord.</a> Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

כבר תארנו את גישה להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים בדג הזברה RB חי. השיטה שלנו מעסיקה transgenesis החולף להביע גרסה מתויגת fluorescently channelrhodopsin, 13 השף tdTomato, בנוירונים חושיים ספציפיים. גישה זו יכולה בקלות להיות מותאמת לשימוש באוכלוסיות תאים אחרות זחל דג זברה. <p class="jove_content"...

פיתוח שיטות optogenetic לקידום או עיכוב רגישות עצבית באורכי גל מוגדר של אור אפשר ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות שונות של תאי עצב במעגלים עצביים השולטים 1 התנהגות, 19, 21. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות כדי להפעיל קבוצות של תאי עצב, אבל זה גם יכול לשמש כדי להפעיל נוירונים בודדים. זחלי דג זברה הם בעיקר נוחות לשיטות אלה מכיוון שהם שקופים, מערכת העצבים שלהם מתפתחת במהירות, ויצירת חיות טרנסגניות היא מהירה ושגרתי. עם זאת, מכשולים טכניים משמעותיים שיש להתגבר אמין כדי להשיג הפעלת תא עצב יחידה. כדי לייעל את ההליך להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים דג זברה, התמקדו בנוירונים חושיים. זחלי דג זברה לזהות מגוון של גירויים חושיים באמצעות שתי אוכלוסיות של תאי עצב: עצב trigeminal, אשר מעצבבות את הראש וRohon-זקן (הנוירונים) RB, אשר מעצבבים את שאר הגוף. כל trigeminal וRB נוירון מקרין האקסון היקפי שסניפים רבים בעור כדי לזהות גירויים והאקסון מרכזי המתחבר למעגלים עצביים במורד זרם. בעלי חיים להגיב למגע מוקדם ככל 21 שעות שלאחר ההפריה (hpf), המציין כי המעגלים החושיים קוהרנטית יצרו 5, 18. במהלך התפתחות רימות לפחות חלק סינפסה נוירונים trigeminal וRB על תא מאוטנר להפעיל תגובות בריחה קלסיות, אך מצטברת ראיות מצביעה על כך שיש כיתות מרובות של נוירונים חושיים עם דפוסים שונים של קישוריות שעשויה לעורר וריאציות על התנהגות הבריחה 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. המוטיבציה שלנו לפיתוח בשיטה זו הייתה לאפיין את התפקוד ההתנהגותי של סוגים שונים של תאי עצב חושיים, אך גישה זו יכולה בעיקרון לשמש כדי לחקור את הפונקציה של תא עצב או כל אוכלוסייה כמעט של הנוירונים בlarval דג זברה. דאגלס et al. תאר שיטה בעבר להפעלת Channelrhodopsin-2-לבטא נוירונים חושיים עם אור כחול, לעורר התנהגות בריחה 3. הגישה שלהם משמשת אלמנט משפר מגן isl1 לנהוג ביטוי של ChR2-EYFP בנוירונים חושיים. transgene זה, עם זאת, דווח להצגת פלואורסצנטי החלש יחסית, שדורש שיתוף הזרקה של כתב שני, כטב&quot;מ :: GFP, כדי לאפשר הדמיה של תאים לבטא ChR2-EYFP. גישה זו הייתה בשימוש כדי לעורר תגובות התנהגות בין 24-48 hpf, אבל אף פעם לא יכולה לעורר תגובת העבר 72 hpf. וכך, בעוד שיטה זו פועלת ללימוד מעגלים עצביים בשלבים מוקדמים מאוד זחל (24-48 hpf), אינו מתאים לאפיון מעגלים עצביים ותגובות התנהגותיות בזחלים מבוגרים יותר, כאשר תגובות התנהגותיות מגוונות יותר ניכרות והמעגלים עצביים הם יותר בוגרים. אנחנו בקשנולשפר את הרגישות של טכניקה זו כדי לאפיין את הפונקציה של אוכלוסיות של נוירונים RB זחל. כדי לשפר את הביטוי שהיינו משפר חושי ספציפי (CREST3) 20 לנהוג ביטוי של LexA-VP16 ומתיחה של רצפי מפעיל כסה (4xLexAop) 11 כדי להגביר את הביטוי של ערוץ האור המופעל מתויג fluorescently. תצורה זו מוגברת ביטוי של הערוץ, ומבטל את הצורך לביטוי שיתוף כתב שני ומאפשר לנו לקבוע באופן ישיר את השפע היחסי של הערוץ בכל נוירון. שימוש ברצף LexA / LexAop היה יתרון נוסף, מאפשר לנו להציג את transgene לתוך שורות כתב דג זברה שמשתמשות במערכת Gal4/UAS. ביטוי זמני של transgene זה הביא לרמות שונות של ביטוי, אך בדרך כלל היה חזק מספיק כדי להמחיש היא את גוף התא ותחזיות axonal של נוירונים בודדים על פני כמה ימים. כדי לייעל sensitivity להדליק השתמשנו באור הופעל ערוץ שף, גרסת channelrhodopsin מורכב דמיוני של channelopsin-1 (Chop1) וchannelopsin-2 (Chop2) עם אתר מוצלב בסליל לולאת EF 13. ערוץ זה מופעל באותו האורך הגל כChR2, אבל דורש עוצמת אור נמוכה יותר להפעלה, מה שהופך אותו רגיש יותר מערוצים אחרים בשימוש נפוץ, כולל ChR2. חלבון השף הותך לחלבון פלואורסצנטי האדום, tdTomato, ומאפשר לנו להקרין לביטוי חלבון ללא הפעלת הערוץ. כמקור אור, השתמש דיודה שאובה ליזר מצב מוצק (DPSS) מצמיד את כבל סיב אופטי, כדי לספק דופק מדויק ובעל עצמה של אור הכחול לאזור מסוים של הזחלים. זה מאפשר לנו למקד את אור ליזר על נוירונים בודדים, ומבטל את הצורך במציאת בעלי חיים מהונדסים נדירים המבטאים את הערוץ בתא עצב יחיד. שימוש בגישה זו, שהיינו מסוגל להפעיל נוירונים RB בודדים, להקליט תגובה התנהגותיתשל עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה, ותמונת הנוירונים מופעלים ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופיה confocal.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> חומרים </td></tr><tr><td> זכוכית פיפטה פסטר </td><td> דיג </td><td> 1367820B </td><td> או שווה ערך (10-15 קוטר מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> 200 סיבים אופטיים מיקרומטר </td><td> ThorLabs </td><td> AFS200/220Y-CUSTOM </td><td> תיקון כבל, אורך: 3 מ &#39;, ניתוק: FC / PC, סוף B: FC / PC, ז&#39;קט: FT030 </td></tr><tr><td> 50 סיבים אופטיים מיקרומטר </td><td> ThorLabs </td><td> AFS50/125Y-CUSTOM </td><td> תיקון כבל, אורך: 3 מ &#39;, ניתוק: FC / PC, סוף B: FC / PC, ז&#39;קט: FT030 </td></tr><tr><td> כלי עקירה מתכוונן </td><td> ThorLabs </td><td> AFS900 </td><td> או כלי עקירה שלוש חור (FTS4) </td></tr><tr><td> סופר יתד יהלומים </td><td> ThorLabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / בראון micropipette פולר </td><td> סאטר מכשירים </td><td> P-97 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> צינורות זכוכית ורוסיליקט עם נימה </td><td> סאטר מכשירים </td><td> BF-100-78-10 </td><td></td></tr><tr><td> עובש הזרקה </td><td> n / </td><td> n / </td><td> איור 5 </td></tr><tr><td> 1.5 צינורות מ&quot;ל צנטריפוגות </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי (100x15 מ&quot;מ) </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי (60x15 מ&quot;מ) </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> לחץ מזרק </td><td> אסי </td><td> MPPI-3 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Micromanipulator ומעמד מתכת </td><td> Narashige </td><td> M152 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> pipettes פלסטיק חד פעמי </td><td> Fisherbrand </td><td> 13-711-7 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> פוקר (בעל פין וסיכת חרק) </td><td> פיין מדע הכלים, בע&quot;מ </td><td> 26018-17 ו26000-70 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> פיין מדע הכלים, בע&quot;מ </td><td> 11255-20 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Microloader פיפטה טיפים </td><td> אפנדורף </td><td> 9300001007 </td><td></td></tr><tr><td> 28.5 מעלות צלזיוס חממה </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> 42 ° C בלוק חום </td><td> כל </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> להבי אזמל ללא מעוקרים # 11 </td><td> כלים מדעיים פיין, Inc </td><td> 10011-00 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> ביתור שללהתמודד </td><td> Zeiss </td><td> STEMI </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> פלורסנט ביתור עם תקן סינון </td><td> כל </td><td> כל </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 או 710 </td><td> או שווי ערך עם לייזרים עבור ה-GFP וRFP, ו10x, 20x ו 40X יעדים </td></tr><tr><td> מצלמת מהירות גבוהה </td><td> AOS Technologies, Inc </td><td> X-PRI (130025-10) </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> 473 ננומטר ליזר נייד </td><td> לייזרי Crystal </td><td> CL-473-050 </td><td> או כוח עליון, עם אפשרות TTL </td></tr><tr><td> S48 ממריץ </td><td> Astro-Med, חלוקת מכשירי דשא בע&quot;מ </td><td> S48K </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> FC / PC לשרוול הזדווגות FC / PC </td><td> ThorLabs </td><td> ADAFC1 </td><td> ne מאיאד לחיבור כבל אופטי </td></tr><tr><td> ליזר משקפי בטיחות </td><td> ThorLabs </td><td> LG10 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> 24 צלחות תרבות </td><td> Genesee </td><td> 25-102 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> שקופיות דיכאון יחידות </td><td> דיג </td><td> S175201 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> אוקיינוס ​​מיידי </td><td> מערכות אקולוגיות מימיות </td><td> IS50 </td><td></td></tr><tr><td> כחול מתילן </td><td> דיג </td><td> S71325 </td><td></td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td> סיגמא </td><td> P4758 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> EMD </td><td> 2125 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> נמוך הממסים agarose </td><td> סיגמא </td><td> A9045 </td> &lt;td&gt; או שווה ערך </td></tr><tr><td> PTU </td><td> סיגמא </td><td> P7629 </td><td></td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> סיגמא </td><td> A5040 </td><td></td></tr><tr><td> מים כחולים / עובר </td><td></td><td></td><td> 10 הליטר DDH 2 O 0.6 גרם מיידי אוקיינוס 6 טיפין מתילן כחול </td></tr><tr><td> פנול אדום </td><td></td><td></td><td> (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.2 מ &#39;KCl) </td></tr><tr><td> 100x PTU </td><td></td><td></td><td> 0.150 גרם PTU 50 המ&quot;ל DDH 2 O לפזר על 70 מעלות צלזיוס, לנער לעתים קרובות aliquot ולאחסן ב -20 ° C </td></tr><tr><td> 1x PTU </td><td></td><td></td><td> 1 המ&quot;ל 100x PTU כחולים / דגי מים 99 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> פתרון Tricaine מניות </td><td></td><td></td><td> 400 מ&quot;ג tricaine 97.9 DDH 2 O </td></tr><tr><td> ~ 2.1 המ&quot;ל 1M טריס, pH9.0 </td><td></td><td></td> &lt;td&gt; להתאים לחומציות ~ 7.0 חנות ב 4 ° C או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך </td></tr></tbody></table>

optogenetic activation of zebrafish somatosensory neurons using chef-tdtomato

דג זברת הזחל הם מתעוררים כמודל לתיאור ההתפתחות והתפקוד של מעגלים עצביים פשוטים. בשל ההפריה שלהם החיצוניות, ההתפתחות מהירה, והשקיפות, דג הזברה מתאים במיוחד גם לגישות optogenetic לחקור תפקוד מעגלים עצבי. בגישה זו, תעלות יונים רגישות לאור מבוטאות בתאי עצב מסוימים, ומאפשרים לניסוי כדי להפעיל או לעכב אותם ברצון ובכך להעריך את תרומתם להתנהגויות מסוימות. יישום שיטות אלו בדג זברת זחל הוא מושגית פשוט, אבל דורש אופטימיזציה של פרטים טכניים. כאן אנו מדגימים הליך לביטוי בגרסת channelrhodopsin נוירונים זחל דג זברה חושי, תאים בודדים מפעילות צילום, הקלטה ואת ההתנהגויות הנגזרות מכך. על ידי החדרה כמה שינויים לשיטות שנקבעו בעבר, גישה זו יכולה לשמש כדי לעורר תגובות התנהגותיות מתא עצב בודד הופעל עדללפחות 4 ימים לאחר ההפריה (DPF). באופן ספציפי, יצר transgene באמצעות חושי נוירון משפר, CREST3, לנהוג הביטוי מתויג channelrhodopsin הגרסה, שף tdTomato. הזרקת transgene זו לתוצאות עוברי שלב 1-תאים בביטוי פסיפס בנוירונים חושיים, שיכול להיות צלם עם מיקרוסקופיה confocal. מאיר זיהה תאים בבעלי חיים אלה עם אור ליזר DPSS ננומטר 473, מודרך דרך כבל סיב אופטי, מעורר התנהגויות שניתן להקליט במצלמת וידאו במהירות גבוהה ונותחו כמותית. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת להתנהגויות לימוד שהושרו על ידי הפעלה כל נוירון דג זברה. שילוב של גישה זו עם הפרעות גנטיות או תרופתיות יהיה דרך רבה עצמה כדי לחקור היווצרות מעגל ותפקודו.

<html><img src="/files/ftp_upload/50184/50184fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1. כבל אופטי להגדיר. (A) שכבות של כבל סיב אופטי. (ב) כבל Stripped סיבים אופטי בפסטר פיפטה. (ג) כבל סיב אופטי בפיפטה פסטר מוצב באמצעות micromanipulator. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato at JoVE.com

Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato

Larval  zebrafish are emerging as a model for describing the development and function  of simple neural circuits. Due to their  external fertilization, ...

optogenetic-activation-zebrafish-somatosensory-neurons-using-chef

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  University of California, Los Angeles. טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

Video: Optogenetic Activation of Zebrafish Somatosensory Neurons using ChEF-tdTomato

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

מיקוד Bulb נוירונים חוש הריח שימוש משולב In vivo Electroporation ו Gal4 מבוסס Enhancer מלכודת קווי דג הזברה

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Somatosensory Event-related Potentials from Orofacial Skin Stretch Stimulation

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of providing precise and controlled stimulation. This article introduces a technique for recording somatosensory event-related potentials (ERP) that uses a novel mechanical stimulation method involving skin deformation using a robotic device. Controlled deformation of the facial skin is used to modulate kinesthetic inputs through excitation of cutaneous mechanoreceptors. By combining somatosensory stimulation with electroencephalographic recording, somatosensory evoked responses can be successfully measured at the level of the cortex. Somatosensory stimulation can be combined with the stimulation of other sensory modalities to assess multisensory interactions. For speech, orofacial stimulation is combined with speech sound stimulation to assess the contribution of multi-sensory processing including the effects of timing differences. The ability to precisely control orofacial somatosensory stimulation during speech perception and speech production with ERP recording is an important tool that provides new insight into the neural organization and neural representations for speech.

This paper introduces a method for obtaining somatosensory event-related potentials following orofacial skin stretch stimulation. The current method can be used to evaluate the contribution of somatosensory afferents to both speech production and speech perception.

פוטנציאל הקשור לאירוע החושית מעור Orofacial למתוח גירוי

Cortical processing associated with orofacial somatosensory function in speech has received limited experimental attention due to the difficulty of ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

אין ויוו יישוב ביטוי של חלבונים Optogenetic באמצעות סרטי משי/AAV

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...