Finanziert wurde dieses Protokoll durch das NICHD Intramural Program an KWR (ZIA HD009002-01). Wir danken Jeff Farrell und seinem Labor für ihr aufschlussreiches Feedback, Will Anderson für die hervorragende technische Unterstützung, Leanne Iannucci für den Stresstest des Protokolls und die Messung der Bestrahlungsstärke und der NIH Shared Zebrafish Einrichtung für ihre harte Arbeit, die Zebrafische gesund zu halten.

Untersuchung der Entwicklung mit optogenetischer Signalmanipulation im Zebrafisch

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Injektion von mRNA ist die derzeitige Strategie, um bOpto-BMP/Nodal an Zebrafischembryonen abzugeben. Diese Methode hat mehrere Nachteile. Erstens variiert die angemessene Menge an mRNA von Labor zu Labor. Die verwendete Menge sollte ausreichen, um die Signalisierung bei Lichteinwirkung robust zu aktivieren, jedoch ohne unbeabsichtigte Dunkelaktivierung. Es ist eine gute Idee, mehrere Mengen zu testen, um optimale mRNA-Spiegel zu finden, und nach der Festlegung Aliquoten eines Mastermixes zu erstellen, um die gleiche Menge an mRNA reproduzierbar einzuführen. Zweitens kann eine ungleichmäßige Verteilung der injizierten mRNA zu einer ungleichmäßigen Signalaktivierung führen. Es wird angenommen, dass die Injektion in die Mitte der Zelle (nicht in das Eigelb) eine gleichmäßige mRNA-Verteilung fördert. Da injizierte mRNA mit der Zeit abgebaut wird, ist dieser Ansatz möglicherweise nicht für Experimente an älteren Embryonen geeignet. In Zukunft könnten diese Probleme durch transgene Zebrafischlinien gelöst werden, die ubiquitär bOpto-BMP/Nodal mit einem mütterlichen oder medikamenteninduzierbaren Promotor exprimieren. Obwohl die Arbeit mit potentiell lichtempfindlichen adulten Zebrafischen in diesem Zusammenhang eine Herausforderung darstellen kann, wurden die transgenen Zebrafische 61,62 und Drosophila 22,34,35,63 mit optogenetischen Werkzeugen erfolgreich entwickelt.
Die Vermeidung einer unbeabsichtigten Photoaktivierung ist eine generelle Herausforderung bei optogenetischen Werkzeugen. Der Einfachheit halber behandeln Sie injizierte Embryonen, die älter als 1,5 hpf sind, als lichtempfindlich. Eine unbeabsichtigte Lichteinwirkung kann oft vermieden werden, indem Teller oder Schalen einfach mit Alufolie umwickelt werden. Für Experimente, die eine visuelle Beobachtung von lebenden Embryonen erfordern, die älter als 1,5 hpf sind, ist es jedoch möglich, rote Lichtquellen zu verwenden oder weiße Lichtquellen mit kostengünstigem Gelfilterpapier abzudecken, das LOV-dimerisierende Wellenlängen blockiert (Materialtabelle).
Der hier beschriebene Leuchtkasten ist für spezifische Anwendungen konzipiert, die eine präzise Steuerung der Lichtbestrahlungsstärke, -dynamik und -wellenlängen erfordern (Abbildung 2). Zu den weiteren Vorteilen dieses Leuchtkastens gehören eine gleichmäßige Lichtbelichtung, eine vernachlässigbare unbeabsichtigte Erwärmung der Proben, ausreichend Platz für mehrere 6-Well-Platten und langlebige, spektral gut charakterisierte Lichtquellen. Je nach Forschungsanwendung können jedoch unterschiedliche Lichtexpositionsstrategien bevorzugt werden. Viele Labore haben einfachere und kostengünstigere Systeme für gleichmäßige Lichtbelichtung mit geringerem Platzbedarf entwickelt, einschließlich der Auskleidung von Inkubatoren mit LED-Streifen, der Aufhängung von LED-Panels über Proben oder der Integration von LEDs in Kulturschalendeckeln 32,38,39,40,64,65,66 . Wichtig ist, dass der in diesem Protokoll verwendete Leuchtkasten es den Benutzern nicht erlaubt, einzelne Vertiefungen unabhängig voneinander zu regulieren (im Gegensatz zu Bugaj et al.52) oder eine räumliche Kontrolle über die Lichtexposition zu ermöglichen. Die räumlich lokalisierte optogenetische Aktivierung wurde mit bOpto-BMP38 und bOpto-Nodal39 unter Verwendung von Lasern in SPIM- bzw. konfokalen Systemen demonstriert und auch mit vielen anderen optogenetischen Strategien in einer Vielzahl von Modellsystemen realisiert (diskutiert in Rogers und Müller12). Einige Ansätze haben sogar eine subzelluläre räumliche Auflösung erreicht 29,30,31. Obwohl die Implementierung von räumlich lokalisierten Lichtbelichtungssystemen außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls liegt, sind räumliche Aktivierungsexperimente mit bOpto-BMP/Nodal theoretisch mit spezialisierten Geräten wie digitalen Mikrospiegelgeräten oder Maskierungsansätzen möglich. Die Leser werden ermutigt, die umfangreiche Literatur über DIY-Leuchtkästen für optogenetische Experimente zu erkunden, bevor sie sich für eine Lichtexpositionsstrategie entscheiden (siehe z.B. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar und Khammash 53 und mehr bei https://www.optobase.org/materials/).
Molekulare optogenetische Strategien bieten oft ein höheres Maß an raumzeitlicher Kontrolle über biologische Prozesse im Vergleich zu historischen Ansätzen wie Mutanten, ektopischer Genexpression, rekombinanten Proteinen und Medikamenten. Leser, die sich für die Vorteile optogenetischer Ansätze interessieren, können andere veröffentlichte Werkzeuge erkunden, die bei Zebrafischen und anderen Organismen verfügbar sind. Dazu gehören Werkzeuge zur Manipulation zusätzlicher Signalwege 32,65,67,68, zur Regulierung der Genexpression 61,64,66,69,70,71, zur Veränderung der Proteinlokalisierung 31,72 und zur Aktivierung der Apoptose 62. Diese und viele andere Werkzeuge sind bequem auf OptoBase katalogisiert, einer kuratierten Webressource für molekulare optogenetische Ansätze28. Für diejenigen, die sich von der Entwicklung neuartiger optogenetischer Werkzeuge inspirieren lassen, bietet die Ressource auch nützliche Beschreibungen von lichtempfindlichen Proteinen, die in einer Vielzahl von Strategien eingesetzt wurden, einschließlich lichtempfindlicher Proteine, die auf grüne, rote und nahinfrarote Wellenlängen reagieren. Wir freuen uns, dass die wissenschaftliche Gemeinschaft das volle Potenzial molekular-optogenetischer Ansätze ausschöpfen kann.

Signalwege ermöglichen es Zellen, auf ihre Umgebung zu reagieren und Aktivitäten auf gewebe- und organismusweiter Ebene zu koordinieren. Zu den Signalen, die für die Embryonalentwicklung entscheidend sind, gehören die Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie, das knochenmorphogenetische Protein (BMP) und Nodal 1,2,3. Während der Embryogenese steuern die Signalwege, die durch diese und andere Signale reguliert werden, den Körperplan, indem sie die Genexpression und zusätzliche Prozesse steuern, um sicherzustellen, dass sich verschiedene Gewebe und Organe richtig entwickeln und miteinander interagieren. Pathologien, einschließlich Geburtsfehler und Krebs, können auftreten, wenn die Signalübertragung oder die Reaktion auf Signale gestört ist 4,5,6,7. Trotz gründlicher Untersuchungen der Signalübertragung muss noch viel mehr darüber entdeckt werden, wie Ebenen und Dynamiken in einer Vielzahl von Kontexten entschlüsselt werden 8,9,10,11, insbesondere während der Entwicklung 12,13,14,15,16,17,18,19.
Um zu verstehen, wie Signale dekodiert werden, wäre ein ideales Experiment, Signalebenen, Timing und/oder Dynamik zu manipulieren - mit einem hohen Maß an räumlicher und zeitlicher Kontrolle - und die Ergebnisse zu bewerten. Zum Beispiel werden präzise räumliche Signalgradienten vorgeschlagen, um sich entwickelnde Gewebe zu strukturieren20, 21. Eine Änderung der räumlichen Verteilung des Signalgradienten würde helfen, diese Hypothesezu testen 22. Darüber hinaus wird die Bedeutung der Signaldynamik für die Erzeugung verschiedener zellulärer Reaktionen immer deutlicher: Derselbe Signalweg kann Zellen anweisen, sich in Abhängigkeit von der Signalfrequenz zu differenzieren oder zu vermehren, zum Beispiel 9,23. Experimentelle Paradigmen, in denen die Signaldynamik leicht manipuliert werden kann, werden wertvoll sein, um die Beziehung zwischen Dynamik und Entscheidungen über das Zellschicksal zu erforschen 8,12,13,14,15.
In der Vergangenheit wurden mehrere Methoden verwendet, um die Signalübertragung in Entwicklungskontexten zu manipulieren, was zu grundlegenden Entdeckungen führte 1,2,3. Die Signalübertragung kann durch Loss-of-Function-Mutanten, ektopische Inhibitorexpression oder Antagonisten blockiert werden. Zu den Methoden zur Aktivierung der Signalübertragung gehören Agonisten, rekombinante Liganden, ektopische Expression von Liganden oder konstitutiv aktiven Rezeptoren und Loss-of-Function-Mutanten von Signalweginhibitoren. Diese Methoden erstrecken sich entlang eines Kontinuums experimenteller Kontrolle. Zum Beispiel können Mutanten und ektopische Expression auf die Vorschlaghammer-Seite des Kontinuums fallen: Mit diesen Ansätzen können dramatische, systemische Veränderungen der Signalwegaktivität zu einem frühen Tod führen und Untersuchungen in späteren Stadien ausschließen oder im Laufe der Zeit zu pleiotropen Effekten führen, die schwer zu entwirren sind. Darüber hinaus ist es oft schwierig, ein Signalisierungsmerkmal nach dem anderen unabhängig zu manipulieren, z. B. Pegel oder Dauer. Am anderen Ende des Kontinuums bieten einige Methoden eine präzisere experimentelle Kontrolle, wie z. B. mikrofluidische Geräte, die Proben Medikamenten oder rekombinanten Proteinen mit zeitlicher und manchmal räumlicher Kontrolle aussetzen 18,24,25, oder genetische Methoden, einschließlich hitzeschockinduzierbarer und gewebespezifischer Promotoren, die ähnliche Vorteile bieten können16,26,27. Diese Methoden können jedoch schwierig auszuführen sein, sind möglicherweise nicht reversibel, haben eine relativ langsame Kinetik oder eine schlechte Auflösung und sind in einigen Modellsystemen möglicherweise nicht verfügbar.
Molekulare optogenetische Ansätze sind eine leistungsstarke Ergänzung dieses Instrumentariums. Diese Ansätze verwenden Proteine, die auf verschiedene Lichtwellenlängen reagieren, um biologische Prozesse zu manipulieren, einschließlich der Signalübertragung 8,12,13,14,15, und wurden über Jahrzehnte für den Einsatz in einer Vielzahl von Systemen von der Zellkultur bis hin zu ganzen Tieren entwickelt 12,13,28. Im Vergleich zu historischen Ansätzen kann die molekulare Optogenetik oft ein höheres Maß an raumzeitlicher Kontrolle über biologische Prozesse bieten: Der Controller in optogenetischen Systemen ist das Licht, und die Kontrolle von Lichtwellenlänge, -intensität, -dauer und -expositionsfrequenz ist relativ einfach. Mit ausgeklügelten Systemen wie Konfokal- und Zwei-Photonen-Mikroskopen ist eine räumliche Kontrolle im subzellulären Bereich möglich 29,30,31. Werkzeuge zur optogenetischen Manipulation der Signalübertragung wurden entwickelt und in mehreren Systemen angewendet, darunter die in Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 und Huang et al.34 beschriebenen Systeme. Unter Ausnutzung der räumlichen Kontrolle, die die Optogenetik bietet, wurde diese Strategie kürzlich verwendet, um einen Signalgradienten in Drosophila-Embryonen zu modifizieren, was zeigt, dass die Embryogenese von Fliegen überraschend robust gegenüber Änderungen dieses Gradienten ist22. Die Reversibilität und die schnelle Ein-/Aus-Kinetik von optogenetischen Signalaktivatoren haben sie auch zu attraktiven Werkzeugen für die Untersuchung der Dekodierung der Signaldynamik 8,12,13,14,15,34,35,36 gemacht.
Der frühe Zebrafischembryo ist ein In-vivo-System , das sich gut für optogenetische Studien eignet, da es extern befruchtet, transparent, mikroskopiefreundlich und genetisch behandelbar ist. Embryonen, die sich außerhalb der Mutter entwickeln, lassen sich leichter mit Licht versorgen, Licht kann in ihr nicht undurchsichtiges Gewebe eindringen und es erreichen, lebende Zebrafischembryonen vertragen die Bildgebung gut (und sind außerdem transparent), und bestehende genetische Methoden bieten neben der Entwicklung nützlicher transgener Methoden unkomplizierte Möglichkeiten für Knockdown- und Überexpressionsexperimente37.
Kürzlich wurden optogenetische Werkzeuge entwickelt, um den BMP38- und Nodal39-Signalweg in Zebrafischembryonen mit Blaulichtexposition zu aktivieren (Abbildung 1). Wir bezeichnen diese Werkzeuge als bOpto-BMP und bOpto-Nodal (b für blaues Licht aktiviert und Opto für optogenetisch). bOpto-BMP/Nodal basieren auf ähnlichen Signalweg-Aktivierungsmechanismen. Die Bindung von BMP- oder Nodal-Liganden an ihre jeweiligen Serin-Threonin-Kinasen treibt Rezeptorkinase-Domänen-Interaktionen an, die zur Phosphorylierung von Signaleffektoren führen (Smad1/5/9 für BMP und Smad2/3 für Nodal). Phosphorylierte Signaleffektoren translozieren dann in den Zellkern und regulieren die Expression des Zielgens3 (Abbildung 1A,D). Diese Rezeptorkinase-Wechselwirkungen können lichtempfindlich gemacht werden, indem Rezeptorkinasen an lichtempfindliche dimerisierende Proteine gekoppelt werden: Bei Lichtexposition sollten diese chimären Proteine dimerisieren, wodurch die Rezeptorkinase-Domänen interagieren und die Signalübertragung aktivieren (Abbildung 1B,C,E,F). Wichtig ist, dass bOpto-BMP/Nodal im Gegensatz zu endogenen Rezeptoren keine extrazellulären Ligandenbindungsdomänen enthalten, was eine ligandenunabhängige Aktivität gewährleistet (Abbildung 1C,F). Diese optogenetische Aktivierungsstrategie wurde zunächst mit Rezeptor-Tyrosinkinasen40,41,42 erreicht und dann auf Rezeptor-Serin-Threonin-Kinasen angewendet.
bOpto-BMP/Nodal verwenden die auf blaues Licht reagierende (~450 nm) homodimerisierende LOV-Domäne (Light-Oxygen-Voltage Sensing) aus dem AUREO1-Protein der Alge Vaucheria fridiga AUREO1 (VfLOV)43,44. Diese Konstrukte bestehen aus einem auf die Membran abzielenden Myristoylierungsmotiv, gefolgt von BMP- oder Nodalrezeptorkinase-Domänen, die mit einer LOV-Domäne fusioniert sind (Abbildung 1B,E). Die Exposition gegenüber blauem Licht sollte eine LOV-Homodimerisierung verursachen, was zu Interaktionen mit Rezeptorkinase-Domänen führt, die zu einer entsprechenden Smad-Phosphorylierung und Signalwegaktivierung führen (Abbildung 1C,F). Für bOpto-BMP wurde eine Kombination von Konstrukten mit den Typ-I-Rezeptorkinase-Domänen von Acvr1l (auch bekannt als Alk8) und BMPR1aa (auch bekannt als Alk3) und der Typ-II-Rezeptorkinase-Domäne von BMPR2a gefunden, um die Signalübertragung optimal zu aktivieren38 (Addgene #207614, #207615 und #207616). Für bOpto-Nodal wird eine Kombination von Konstrukten mit der Typ-I-Rezeptorkinase-Domäne von Acvr1ba und der Typ-II-Rezeptorkinase-Domäne von Acvr2ba verwendet39.
bOpto-BMP/Nodal wurden durch Injektion von mRNA im Einzelzellstadium in frühe Zebrafischembryonen eingeführt und verwendet, um die Rolle der Signaldauer bei der Nodal-Interpretation39 zu untersuchen, um festzustellen, warum Zebrafische die Fähigkeit verlieren, auf Nodal45 zu reagieren, und um zu untersuchen, wie BMP-Zielgene auf verschiedene BMP-Signalebenen reagieren38. Es ist wahrscheinlich, dass diese Instrumente auch in Zukunft bei einer Vielzahl von Untersuchungen nützlich sein werden. Die Stärke der optogenetischen Signalaktivatoren ist jedoch auch ihre Schwäche: Lichtempfindliche Proben müssen mit Vorsicht behandelt werden, um eine unbeabsichtigte ektopische Signalaktivität zu vermeiden. Die Einwirkung von Raumlicht oder Sonnenlicht kann bOpto-BMP/Nodal aktivieren.
Dieses Protokoll enthält praktische Vorschläge für die Verwendung von mRNA-kodierten LOV-basierten BMP- und Nodal-Aktivatoren in frühen Zebrafischembryonen. Es beginnt mit der Beschreibung einer Strategie zum Aufbau eines Leuchtkastens zur Steuerung einer gleichmäßigen Lichtexposition und Temperatur (Abbildung 2, Ergänzungsdatei 1, Ergänzungsdatei 2, Ergänzungsdatei 3, Ergänzungsdatei 4, Ergänzungsdatei 5, Ergänzungsdatei 6, Ergänzungsdatei 7, Ergänzungsdatei 8). Anschließend werden zwei wichtige Kontrollexperimente beschrieben, die bestimmen, ob sich ein optogenetischer Signalaktivator wie erwartet verhält, d. h. die Signalwegaktivität nur aktiviert, wenn er Licht ausgesetzt wird (Abbildung 3). Der erste Kontrolltest beinhaltet die Untersuchung der Phänotypen einen Tag nach der Befruchtung in lichtexponierten und nicht exponierten Embryonen (Abbildung 3A). mRNA-injizierte, lichtexponierte Embryonen, aber keine nicht-exponierten Embryonen, sollten BMP oder Knoten-Überexpression phänophonieren (Abbildung 4A,B; Insbesondere BMP-Phänotypen sind zu diesem Zeitpunkt deutlich unterscheidbar(Punkt 46). Dieser Assay bietet eine schnelle Aktivitätsauslesung. Um festzustellen, ob die Phänotypen spezifisch durch einen Überschuss an BMP oder Nodal-Signalgebung verursacht werden, und um die Veränderung der Signalwerte direkt zu beobachten, wird die Immunfluoreszenzfärbung verwendet, um phosphorylierte Signaleffektoren (pSmad1/5/9 bzw. pSmad2/3) nach einer 20-minütigen Lichtexposition um das späte Blastula-/frühe Gastrulationsstadium herum nachzuweisen, wenn die Signalaktivität gut beschrieben wurde12. 16,17,47,48,49,50 (Abbildung 3B und Abbildung 4C). (Es ist zu beachten, dass, obwohl sowohl für bOpto-BMP38 als auch für bOpto-Nodal39 eine räumlich lokalisierte Aktivierung nachgewiesen wurde, dieses Protokoll nur eine gleichmäßige Lichtexposition und Signalaktivierungsstrategien beschreibt.) Es ist ratsam, diese Kontrollexperimente vor der Anwendung von bOpto-BMP/Nodal auf bestimmte Forschungsfragen durchzuführen, um ideale lokale Versuchsbedingungen zu bestimmen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

Signalwege orchestrieren grundlegende biologische Prozesse, einschließlich Entwicklung, Regeneration, Homöostase und Krankheit. Methoden zur experimentellen Manipulation der Signalübertragung sind erforderlich, um zu verstehen, wie die Signalübertragung in diesen vielfältigen Kontexten interpretiert wird. Molekulare optogenetische Werkzeuge können reversible, abstimmbare Manipulationen der Signalwegaktivität mit einem hohen Maß an raumzeitlicher Kontrolle ermöglichen und wurden in vitro, ex vivo und in vivo angewendet. Diese Werkzeuge koppeln lichtempfindliche Proteindomänen, wie z. B. die LOV-Domäne (Blue Light Homodimerizing Light-Oxygen-Voltage Sensing), mit Signaleffektoren, um eine lichtabhängige experimentelle Kontrolle über die Signalübertragung zu erhalten. Dieses Protokoll enthält praktische Richtlinien für die Verwendung des LOV-basierten knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) und der Nodal-Signalaktivatoren bOpto-BMP und bOpto-Nodal im optisch zugänglichen frühen Zebrafischembryo. Es werden zwei Kontrollexperimente beschrieben: Ein schneller Phänotyp-Assay zur Bestimmung geeigneter Versuchsbedingungen und ein Immunfluoreszenz-Assay zur direkten Beurteilung der Signalübertragung. Zusammen können diese Kontrollexperimente dazu beitragen, eine Pipeline für den Einsatz optogenetischer Werkzeuge in frühen Zebrafischembryonen zu etablieren. Diese Strategien bieten eine leistungsstarke Plattform, um die Rolle der Signalübertragung in Entwicklung, Gesundheit und Physiologie zu untersuchen.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

Autor im Rampenlicht: Manipulation der Signalübertragung in Zebrafischembryonen, um Entscheidungen über das Schicksal von Zellen zu entschlüsseln 

Optogenetische Signalaktivierung in Zebrafischembryonen

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

Das Ziel der beiden hier beschriebenen Kontrollexperimente ist es, festzustellen, ob bOpto-BMP/Nodal ihre jeweiligen Signalwege als Reaktion auf Blaulichtexposition aktivieren, ohne die Signalübertragung in Abwesenheit von Licht zu beeinflussen, wie erwartet. Verwenden Sie diese Steuerelemente, um den geeigneten experimentellen Arbeitsablauf in Ihrem Labor einzurichten, bevor Sie bOpto-BMP/Nodal auf Ihre Forschungsfragen anwenden.
Der Phänotypisierungsassay kann in nur 2 Tagen abgeschlossen werden und liefert einen nützlichen Hinweis auf die Signalaktivität und Phototoxizität (Abbildung 3A). Injizierte, blaulichtexponierte Embryonen sollten einen übermäßigen BMP-Signalweg phänophonieren (Ventralisation46; Abbildung 4A, linkes Bild) oder Knotensignalisierung (Entwicklungsstörungen im Zusammenhang mit dem zusätzlichen Mesendoderm 1,3,47,57,58,59,60 (Abbildung 4A, rechtes Bild)). Wenn injizierte, lichtexponierte Embryonen aphenotypisch sind, testen Sie die Qualität der mRNA und erwägen Sie, mehr zu injizieren, und überprüfen Sie die Lichtexpositionsstrategie, um eine konstante Exposition gegenüber hellem Licht zu gewährleisten (~450 nm Licht mit einer Bestrahlungsstärke von 45 W/m2 sollte die Signalübertragung stark aktivieren). Im Gegensatz dazu sollten injizierte, nicht exponierte Embryonen identisch mit nicht injizierten Geschwistern aussehen. Wenn injizierte, nicht exponierte Embryonen Phänotypen aufweisen, reduzieren Sie die Menge der injizierten mRNA und bewerten Sie den Versuchsaufbau neu, um sicherzustellen, dass nicht exponierte Embryonen vor Lichtexposition geschützt sind. Die in Abbildung 4B gezeigten Daten zeigen die Ergebnisse typischer Phänotypisierungsexperimente mit geeigneten mRNA-Mengen und Expositions-Bedingungen: Eine starke Signalaktivität ist in injizierten, lichtexponierten Embryonen offensichtlich, wobei nur ein kleiner Teil der injizierten, nicht exponierten Embryonen Phänotypen aufwies.
Der Phänotypisierungs-Assay bietet auch die Möglichkeit, die Phototoxizität zu bewerten. Wenn die Phototoxizität vernachlässigbar ist, sollten nicht injizierte, lichtexponierte Embryonen Wildtyp-Embryonen sein, ähnlich wie nicht injizierte, nicht exponierte Embryonen. Wenn nicht injizierte, lichtexponierte Embryonen Defekte aufweisen, aber keine injizierten, nicht exponierten Embryonen, sollten Sie in Betracht ziehen, die Lichtbestrahlung zu verringern. Eine Bestrahlungsstärke von 45 W/m2 aktiviert die Signalübertragung ohne offensichtliche Phototoxizität. Die in Abbildung 4B gezeigten Daten zeigen keine besorgniserregenden Unterschiede zwischen nicht injizierten, lichtexponierten und nicht injizierten, nicht exponierten Embryonen, was auf eine vernachlässigbare Phototoxizität hindeutet.
Obwohl die Immunfluoreszenz-Assays im Vergleich zum Phänotypisierungs-Assay (2 Tage) mehr Zeit und Mühe (~1 Woche) erfordern, bietet die Immunfluoreszenz-Färbung ein direktes Auslesen der Signalwegaktivität und kann subtile Signalveränderungen aufdecken, die sich möglicherweise nicht in der groben Morphologie widerspiegeln. Die Immunfluoreszenz ist besonders wichtig, um das Ansprechen auf bOpto-Nodal zu beurteilen, da eine übermäßige Nodal-Signalgebung oft dazu führt, dass Embryonen um 1 dpf lysieren, was viele Ursachen haben kann - im Gegensatz zu den spezifischen Ventraisationsphänotypen, die für die übermäßige BMP-Signalgebung charakteristisch sind46 (Abbildung 4A). Injizierte, Blaulicht-exponierte Embryonen sollten im Vergleich zu nicht injizierten, lichtexponierten Embryonen einen gleichmäßigen Anstieg der Smad1/5/9- oder Smad2/3-Phosphorylierung aufweisen. Wenn die Werte nicht oder nur schwach erhöht sind, testen Sie die Qualität der mRNA und erwägen Sie, mehr zu injizieren, und überprüfen Sie die Lichtexpositionsstrategie. Eine 20-minütige Exposition gegenüber blauem Licht mit einer Bestrahlungsstärke von 45 W/m2 bei etwa 40% Epibolie sollte die Signalübertragung stark aktivieren. Wenn die pSmad-Färbung ungleichmäßig ist, versuchen Sie, mRNA in die Mitte der Zelle (und nicht in das Eigelb) zu injizieren, was zu einer gleichmäßigeren mRNA-Verteilung führen kann.
Injizierte, nicht exponierte Embryonen sollten einen pSmad-Spiegel aufweisen, der mit dem von nicht injizierten Embryonen vergleichbar ist. Anekdotisch haben wir eine undichtere Smad-Phosphorylierung mit bOpto-Nodal als mit bOpto-BMP beobachtet. Wenn die pSmad-Spiegel in injizierten, nicht exponierten Embryonen erhöht sind, ist die Menge der injizierten mRNA zu reduzieren. Darüber hinaus sollte der Versuchsaufbau neu bewertet werden, um sicherzustellen, dass 1) nicht exponierte Embryonen nicht versehentlich Licht ausgesetzt werden und 2) die Lichtexposition während der Fixierung minimal ist. Während des Fixierungsschritts ist es wichtig, dass zwischen der Entnahme aus dem Leuchtkasten und dem Eintauchen in Formaldehyd nicht mehr als 45 s vergehen. Minimieren Sie während dieses Schritts außerdem die Exposition gegenüber Raumlicht und Sonnenlicht, indem Sie Jalousien schließen, weiße Lichtquellen ausschalten, rotes Licht verwenden oder weiße Lichtquellen mit blaulichtblockierendem Gelfilterpapier abdecken (Materialtabelle).
Die Daten in Abbildung 4C zeigen die Ergebnisse typischer Immunfluoreszenz-Färbeexperimente mit geeigneten mRNA-Mengen und Lichtexpositionsbedingungen: Die pSmad-Spiegel sind bei nicht injizierten und nicht exponierten Embryonen ähnlich, während injizierte, lichtexponierte Embryonen höhere Smad-Phosphorylierungswerte aufweisen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> Abbildung 1: Aktivierungsstrategie des bOpto-BMP- und -Nodal-Signalwegs . (A) Der endogene BMP-Signalweg wird durch die Bindung des BMP-Liganden aktiviert, was zur Bildung eines Typ-I/II-Rezeptorkomplexes, zur Phosphorylierung von Smad1/5/9 und zur Expression von BMP-Zielgenen führt. Die Typ-I-Rezeptoren BMPR1aa und Acvr1l werden auch als Alk3 bzw. Alk8 bezeichnet. BMPR2a ist ein Typ-II-Rezeptor. (B) bOpto-BMP-Konstrukte38. Mutmaßliche Kinasedomänen von BMPR1aa und Acvr1l sind mit LOV fusioniert; Die BMPR2a-LOV-Fusion enthält die mutmaßliche Kinasedomäne und die C-terminale Domäne (CTD) des Rezeptors. Alle Fusionen sind membranspezifisch mit einem Myristoylierungsmotiv (Myr) versehen. Die Domänen sind durch Glycin-Serin (GS)-Linker getrennt. Konstrukte werden an der CTD mit einem HA-Epitop-Tag markiert. Es wurde festgestellt, dass diese Kombination von drei Konstrukten die BMP-Signalübertragung optimal aktiviert. (C) bOpto-BMP-vermittelte Aktivierung des BMP-Signalwegs. Wenn sie blauem Licht ausgesetzt werden, dimerisieren LOV-Domänen, was vermutlich die Bildung komplexer Komplexe und die Aktivierung von Signalen auslöst. (D) Der endogene Nodal-Signalweg wird durch Nodal-Ligandenbindung aktiviert, was zur Bildung eines Typ-I/II-Rezeptorkomplexes, zur Phosphorylierung von Smad2/3 und zur Expression von Nodal-Zielgenen führt. Der Typ-I-Rezeptor Acvr1ba und der Typ-II-Rezeptor Acvr2ba werden auch als Acvr1b bzw. Acvr2b bezeichnet. (E) bOpto-Knoten-Konstrukte39. Mutmaßliche Kinasedomänen von Acvr1ba und Acvr2ba sind mit LOV fusioniert. Alle Fusionen sind membranspezifisch mit einem Myristoylierungsmotiv (Myr) versehen. Domains werden durch GS-Linker getrennt. Konstrukte werden an der CTD mit einem HA-Epitop-Tag markiert. (F) bOpto-Nodal-vermittelte Aktivierung des Nodal-Signalwegs. Wenn sie blauem Licht ausgesetzt werden, dimerisieren LOV-Domänen, was vermutlich die Bildung komplexer Komplexe und die Aktivierung von Signalen auslöst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> Abbildung 2: Temperaturgesteuerter Leuchtkasten für optogenetische Experimente . (A) Eine LED-Mikroplattenbeleuchtung wird mit einem speziell angefertigten LED-Halter an der Oberseite eines Inkubators montiert. Zebrafischembryonen in einer 6-Well-Platte auf dem ersten Regal werden durch ein Loch, das in die Oberseite des Inkubators gebohrt wurde, dem Licht ausgesetzt. Das untere Regal enthält einen zweiten Satz unbelichteter Kontrollembryonen in einer mit Aluminiumfolie umwickelten 6-Well-Platte. Die Tür des Inkubators ist mit einer Dichtung ausgekleidet, um eine unbeabsichtigte Einwirkung von Raumlicht oder Sonnenlicht zu verhindern. (B) Einzelheiten des Verfahrens zum Anlegen eines Lochs in den Inkubator mit einem Stufenbohrer. Das hier verwendete Inkubatormodell verfügt über eine Innenverkleidung, für die ein zweites, größeres Loch gebohrt werden musste (Materialtabelle). (C) Detail der kundenspezifischen LED-Halterung, die für ein Beleuchtungssystem mit drei Wellenlängen entwickelt wurde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> Abbildung 3: Arbeitsablauf des bOpto-BMP/Nodal-Experiments. Phänotyp-Assay und pSmad-Immunfluoreszenzfärbung zur Testaktivität von bOpto-BMP/Nodal. Die Embryonen werden im Einzelzellstadium mit mRNA injiziert und spätestens 1,5 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einen Leuchtkasten übertragen. (A) Phänotyp-Assay. Injizierte Embryonen und nicht injizierte Geschwister werden im Dunkeln aufgezogen oder gleichmäßigem blauem Licht ausgesetzt, beginnend bei 1,5 hpf bis 1 Tag nach der Befruchtung (dpf). Die optogenetische Signalaktivität kann bewertet werden, indem Embryonen auf Phänotypen untersucht werden, die mit einer übermäßigen Signalwegaktivität übereinstimmen. (B) pSmad-Immunfluoreszenzfärbung. Injizierte Embryonen und nicht injizierte Geschwister werden im Dunkeln aufgezogen, bis 40% Epibolie (~6 hpf) erreicht sind. Die Hälfte der injizierten und die Hälfte der nicht injizierten Embryonen werden dann 20 Minuten lang gleichmäßigem blauem Licht ausgesetzt. Nach der Exposition werden alle Embryonen fixiert und einer Immunfluoreszenzfärbung auf pSmad unterzogen. Erhöhte Spiegel von pSmad1/5/9 oder pSmad2/3 spiegeln die optogenetische Aktivierung des BMP- bzw. Nodal-Signalwegs wider. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> Abbildung 4: Beurteilung von lichtaktivierten Signalantworten in Zebrafischembryonen. Zebrafischembryonen wurden im Einzelzellstadium mit mRNA injiziert, die für bOpto-BMP/Nodal kodiert. (A) Die Embryonen wurden entweder im Dunkeln aufgezogen oder 1,5 Stunden nach der Befruchtung (hpf) gleichmäßigem blauem Licht ausgesetzt. Die Phänotypen wurden 1 Tag nach der Befruchtung (dpf) bewertet. Repräsentative Phänotypen werden gezeigt. Ein Überschuss an BMP-Signalen führt zu einer Ventralisierung (linkes Bild), während ein Überschuss an Knotensignalen Entwicklungsstörungen verursacht, die mit einem zusätzlichen Mesendoderm assoziiert sind (rechtes Bild). Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Quantifizierung des Phänotyps. Injizierte Embryonen und nicht injizierte Geschwister wurden im Dunkeln ab 1,5 hpf (schwarze Zwiebel) aufgezogen. Die Hälfte der injizierten und die Hälfte der nicht injizierten Embryonen wurden einheitlichem blauem Licht (blaue Glühbirne) ausgesetzt. (C) Injizierte Embryonen und nicht injizierte Geschwister wurden im Dunkeln ab 1,5 hpf (schwarze Zwiebel) aufgezogen. Bei 40% Epibolie (~6 hpf) wurde die Hälfte der injizierten und die Hälfte der nicht injizierten Embryonen einheitlichem blauem Licht (blaue Bulb) ausgesetzt. Nach 20 Minuten wurden alle Embryonen fixiert und einer Immunfluoreszenzfärbung auf phosphoryliertes Smad1/5/9 oder Smad2/3 unterzogen. Höhere pSmad-Intensitäten deuten auf eine erhöhte BMP/Nodal-Signalgebung hin. Maßstabsleiste = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzungsdatei 1: Leuchtkasten-Vollmontage. 3D-PDF-Datei mit einer 3D-Ansicht der gesamten Leuchtkastenbaugruppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 2: Explosionszeichnung des Leuchtkastens. 3D-PDF-Datei mit einer 3D-Ansicht der explodierten Leuchtkastenbaugruppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 3: Große leichte Dichtung. CAD-Zeichnungsdatei (. DWG-Format), um die große Lichtdichtung für die LED-Fassung mit einem Lasercutter herzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 4: Kleine leichte Dichtung. CAD-Zeichnungsdatei (. DWG-Format), um die kleine Lichtdichtung für den LED-Halter mit einem Lasercutter herzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 5: Plattformsockel aus Acryl. CAD-Zeichnungsdatei (. DWG-Format), um den LED-Halter aus Acryl-Plattformsockel mit einem Laserschneider herzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 6: Acrylplattform vertikal. CAD-Zeichnungsdatei (. DWG-Format), um die LED-Halter-Acrylplattform vertikal mit einem Laserschneider herzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 7: Acrylstütze links. CAD-Zeichnungsdatei (. DWG-Format), um den linken Träger aus LED-Halter aus Acryl mit einem Laserschneider herzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 8: Acryl-Stütze rechts. CAD-Zeichnungsdatei (. DWG-Format), um den rechten Träger aus Acryl des LED-Halters mit einem Laserschneider herzustellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions at JoVE.com

Die optogenetische Manipulation von Signalwegen kann eine leistungsfähige Strategie sein, um zu untersuchen, wie Signale in der Entwicklung, Regeneration, Homöostase und Krankheit entschlüsselt werden. Dieses Protokoll enthält praktische Richtlinien für die Verwendung von Licht-Sauerstoff-Spannungs-Sensordomänen-basierten Knoten- und knochenmorphogenen Protein-Signalaktivatoren (BMP) im frühen Zebrafischembryo.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Um den Körperbau des Embryos während der Entwicklung zu etablieren, sollen Zellen Signalintensitäten, Dynamiken und Kombinationen entschlüsseln. Wir nutzen die Optogenetik, um diese Signalfunktionen in Zebrafischembryonen zu manipulieren. Dieser Ansatz wird uns helfen zu verstehen, wie embryonale Zellen Signale entschlüsseln, um einige der frühesten Sulfatentscheidungen zu treffen. Die hier diskutierten optogenetischen Ansätze verwenden Licht als Fernbedienung, um BMP oder Knotensignale schnell und reversibel zu aktivieren.Da die Lichtexposition leicht zu lenken ist, können diese Ansätze eine verbesserte experimentelle Kontrolle über die Signalübertragung bieten. Unser Protokoll führt die Verwendung dieser lichtempfindlichen Werkzeuge in Zebrafischembryonen ein. Mit dieser verbesserten zeitlichen und räumlichen Kontrolle sollte es nun möglich sein, präzise Signalmodifikationen während der Entwicklung von Zebrafischen durchzuführen.Wir erwarten, dass dies unser Verständnis darüber vertiefen wird, wie Zellen Signale entschlüsseln, um schwache Entscheidungen zu treffen, was dazu beitragen wird, zu enthüllen, wie sich der embryonale Körperbau entwickelt.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K Aufrufe.  NIH. Um den Körperbau des Embryos während der Entwicklung zu etablieren, sollen Zellen Signalintensitäten, Dynamiken und Kombinationen entschlüsseln. Wir nutzen die Optogenetik, um diese Signalfunktionen in Zebrafischembryonen zu manipulieren. Dieser Ansatz wird uns helfen zu verstehen, wie embryonale Zellen Signale entschlüsseln, um einige der frühesten Sulfatentscheidungen zu treffen. Die hier diskutierten optogenetischen Ansätze verwenden Licht als Fernbedienung, um BMP oder Knotensignal...

Serie: Autor im Rampenlicht: Manipulation der Signalübertragung in Zebrafischembryonen, um Entscheidungen über das Schicksal von Zellen zu entschlüsseln 