פרוטוקול זה מתאר שיטה בעלות נמוכה לביצוע בדיקות כדאיות תרופתיות באמצעות אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם השימוש בעלות נמוכה וחומרים זמינים וציוד מעבדה. ניתן להשתמש בשיטה זו לפני ביצוע מסכי תרופות יקרים בעלי תפוקה גבוהה.
למרות שהשיטה עוסקת בביצוע בדיקות כדאיות תרופתיות באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות, ניתן ליישם אותה על כל מערכת אורגנואידים, כולל אלה שמקורם במורין. כדי להתחיל, התבונן בתמצית קרום המרתף או BME המכיל אורגנואידים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להבטיח מפגש של 70% עד 90%. בעזרת פיפטה, מוסיפים מיליליטר עד שני מיליליטר של מצע בסיס שחומם מראש לבאר המכילה את האורגנואידים ומנתקים מכנית את האורגנואידים על ידי הדבקתם מעלה ומטה.
מעבירים את כל תרחיף האורגנואיד לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומערבלים את הצינור למשך חמש עד 10 שניות כדי לפרק עוד יותר את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב 1, 107 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בעזרת פיפטה חד-ערוצית, שאפו והשליכו את הסופרנטנט.
השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה אורגנואידי שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס, והעבר את המתלה לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לדגור על הדגימה במשך שבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס. ואז צנטריפוגה את התוצאה בהשעיית התא ב 1, 107 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מצע בסיס שחומם מראש. לבנות מחדש את התאים בתערובת של מדיה בסיס BME, שמירה על ריכוז סופי של 20, 000 תאים לכל 10 מיקרוליטר. צלחת טיפה אחת של שלושה מיקרוליטר של התאים המרחפים לכל באר של צלחת באר אטומה שחורה 96.
לדגור על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חומר אורגנואיד מתקדם שחומם מראש לכל באר לפני הדגירה על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות. בצע טיפול תרופתי של אורגנואידים יומיים לאחר ציפוי אותם.
בצע בדיקת כדאיות על האורגנואידים שבעה ימים לאחר הטיפול התרופתי. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מגיב בדיקת כדאיות לכל באר, הביאו את הנפח הכולל ל -200 מיקרוליטר, ונערו את הצלחת ב 80 סל"ד במשך חמש דקות. לאחר מכן מניחים לצלחת לדגור בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות נוספות.
בינתיים, הפעל את קורא לוחות bioluminescence ופתח את תוכנת בקרת העיניים. נווט כדי להתחבר למכשיר"ובחר Infinite 200Pro"Select luminescence"וסקריפט ברירת המחדל"Next מהתפריט הנפתח, בחר BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black"כסוג הצלחת להגדרת פרמטרי ההארה. הקצה הנחתה כללא.
זמן אינטגרציה כ- 1000 אלפיות שנייה וזמן יישוב כאפס אלפיות שניה. לבסוף, חשוף את הצלחת, טען אותה על קורא הלוחות ולחץ על התחל"כדי להתחיל. תמונות ברייטפילד נרכשו עבור שני אורגנואידים שונים שמקורם במטופל, או PDOs, המשמשים בפרוטוקול.
PDO אחד, נגזר מביופסיה של הגידול ו-PDO שניים שמקורם במימת. תוצאות בדיקת הכדאיות חשפו את אחוז התאים החיים ב-PDO 1 וב-PDO שניים לאחר ששניהם טופלו בריכוזים משתנים של קרבופלטין. קצב הגידול המחושב, או ערכי GR, הושוו כנגד ריכוזי הקרבופלטין המתאימים, ומדדי GR גילו כי ערך GR50 עבור PDO אחד היה גבוה בהרבה מזה של PDO שתיים.
זה הצביע על כך ש- PDO אחד היה עמיד יותר לכימותרפיה פלטינום בזמן הציפוי, חיוני כי טיפת שלושה מיקרוליטר של תרחיף התא ממוקמת ישירות במרכז הבאר. אם הטיפה ממוקמת קרוב לקצה הבאר, זה עלול לגרום לטיפה לקרוס, להשפיע על תוצאות הבדיקה.
