המימון התקבל מהמחלקה לביו-הנדסה ע"ש פישל (KM), T32 GM080201 (MA), מלגת הקיץ של ווגל (MA), קרן LAM (KM) ואיגוד הריאות האמריקאי (KM). המחברים מבקשים להודות למישל קלוז'ינסקי על עזרתו בעריכה.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של UMD (IACUC). רקמות מנקבות עכברי C57BL/6J בנות 7 עד 9 שבועות שימשו למחקרים אלה. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. דיסוציאציה ידנית
הערה: שלב זה נלקח מ- Maisel K. et al.7.
<ol><li>הסר רקמה שנותחה והנח אותה באמצעי תרבית תאים קרים עם סרום בקר עוברי 5% (FBS).</li>
	<li>קוצצים את הרקמה באמצעות מספריים חדים לדיסקציה עד שהשברים קטנים מ-1 מ"מ בכל ממד.</li>
	<li>מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומוסיפים 5 מ"ל מדיה.</li>
	<li>הוסף אנזימי עיכול המבוססים על סוגי הרקמה והתאים המבודדים. עבור הניסויים המוצגים, השתמש Collagenase 4 (1 מ"ג / מ"ל), Collagenase D (1 מ"ג / מ"ל), ו DNase (40 מיקרוגרם / מ"ל).</li>
	<li>יש לדגור על שייקר או נדנדה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C צלזיוס עם תסיסה עדינה לאורך כל הדגירה. פיפטה את המדגם למעלה ולמטה 100 פעמים.</li>
	<li>הוסף EDTA כדי להשיג נפח דגימה עם ריכוז של 5 mM. פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה 100 פעמים, ולאחר מכן פיפטה נמרצת את הדגימה למעלה ולמטה 100 פעמים.</li>
	<li>העבירו את הדגימה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר ואספו אותה בצינור של 50 מ"ל או 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות פיפטה ותאי resuspend ב 1 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים. יש לדגור במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>נטרל את מאגר הליזיס על ידי הוספת 9 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר 1X (PBS).</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים שנאספו שוב ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend תאים במאגר הרצוי או מדיה.</li>
</ol>2. דיסוציאציה מכנית חצי אוטומטית
<ol><li>הניחו רקמה מנותחת במצע תרבית תאים קרים עם סרום בקר עוברי 5% (FBS). הערה: פרוטוקול זה מיועד לבידוד תאים מרקמות מוצקות.</li>
	<li>קוצצים את הרקמה באמצעות מספריים חדים לדיסקציה עד ששברי הרקמה מגיעים לכ-5 מ"מ בכל ממד. מעבירים את הרקמה הקצוצה לצינור C ומוסיפים 1 מ"ל מדיה.</li>
	<li>טען את צינור C למכשיר. התאימו את לוחית מחזיק הצינור (איור משלים 1A) מעל תחתיות הצינור בצורת D.</li>
	<li>הצמידו את הצינורות ללוחית המנוע על-ידי הצמדת זרועות המתח ללוח האקרילי (איור משלים 3).</li>
	<li>הגדר תוכנית מותאמת אישית: קדימה, 30 שניות; הפוך, 10 שניות; לולאה, 4 פעמים.<ol><li>בחר מצב מותאם אישית מהתפריט הראשי על ידי לחיצה על הלחצן הכחול .</li>
		<li>בתפריט המצב המותאם אישית הראשון, ציין את משך הסיבוב קדימה ל- 30 שניות על-ידי לחיצה על הלחצן האדום עד שהערך במסך יקרא 30 שניות. לחץ על הכפתור הכחול כדי לבחור ערך זה ולהתקדם למסך התפריט הבא.</li>
		<li>בתפריט המצב המותאם אישית השני, ציין את משך הסיבוב ההפוך ל- 10 שניות על-ידי לחיצה על הלחצן האדום עד שהערך על המסך יקרא 10 שניות. לחץ על הכפתור הכחול כדי לבחור ערך זה ולהתקדם למסך התפריט הבא.</li>
		<li>בתפריט המצב המותאם אישית השלישי, ציין את מספר הפעמים שיש לחזור על הבחירות שנקבעו בשלבים 2.5.2-2.5.3 על-ידי לחיצה על הלחצן האדום עד שהערך על המסך יקרא 4X. לחץ על הכפתור הכחול כדי לבחור ערך זה ולהפעיל את התוכנית. הערה: תוכניות מותאמות אישית אינן מאוחסנות בזיכרון ההתקן, אך ניתן לתכנת אותן כאחת התוכניות המוגדרות מראש לפעולה מהירה יותר (הוראות תיכנות התקנים מסופקות בקובץ משלים 1).</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את התוכנית המותאמת אישית במהירות 200 סל"ד על-ידי התאמת חוגת בקרת המתח (איור משלים 3) עד שערך הסל"ד המחושב בפינה הימנית התחתונה של מסך ה-LCD יקרא 200 (איור משלים 4).</li>
	<li>הוסף אנזימי עיכול במדיה של 4 מ"ל בהתאם לסוגי הרקמה והתאים המבודדים. הערה: עבור הניסויים המוצגים, השתמש ב-Collagenase 4 (1 מ"ג/מ"ל), Collagenase D (1 מ"ג/מ"ל) ו-DNase (40 מיקרוגרם/מ"ל).</li>
	<li>טען את צינור C למכשיר וחזור על שלבים 2.3-2.6 כדי להפעיל את התוכנית הבאה במהירות 200 סל"ד: קדימה, 30 שניות; הפוך, 10 שניות; לולאה, 4 פעמים.</li>
	<li>העבר את המכשיר כשהצינורות עדיין טעונים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.</li>
	<li>טען את צינור C למכשיר וחזור על שלבים 2.3-2.6 כדי להפעיל את התוכנית הבאה במהירות 50 סל"ד: קדימה, 270 שניות; הפוך, 30 שניות; לולאה, 9 פעמים.</li>
	<li>הוסף EDTA כדי להשיג ריכוז של 5 mM בדגימה.</li>
	<li>טען את צינור C למכשיר וחזור על שלבים 2.3-2.6 כדי להפעיל את התוכנית הבאה במהירות 100 סל"ד: קדימה, 30 שניות; הפוך, 10 שניות; לולאה, פעמיים.</li>
	<li>דחפו את הדגימה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר ואספו אותה בצינור של 50 מ"ל או 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה ולהשהות מחדש תאים ב-1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים. יש לדגור במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>נטרל את מאגר הליזיס עם 9 מ"ל של מלח חוצץ פוספט קר (PBS).</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים שנאספו שוב ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה והשהו מחדש תאים במאגר או במדיה הרצויים.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים
<ol><li>נתח את הנתונים באמצעות תוכנת גרפים וניתוח סטטיסטי (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>השתמש במבחני t לא מזווגים של וולש כדי להשוות זוגות של דגימות או קבוצות, עם גודל מדגם n > 4 עכברים המייצגים 2 ניסויים משוכפלים. הערה: הבדלים נחשבו מובהקים סטטיסטית כאשר (p < 0.05). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.</li>
</ol>

דיסוציאציה חצי אוטומטית של רקמות מכניות-אנזימטיות לאנליזה של תא בודד

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

מכשיר זה תוכנן להרכבה קלה בסביבת המחקר כדי לספק תרחיפים חד-תאיים מרקמות שלמות לניתוח תא בודד לאחר מכן. התכונות, למרות שהן בסיסיות, מספיקות כדי לענות על הצרכים של חוקרים במסגרות אקדמיות ומחוצה לה. יתרון מרכזי של שימוש במכשיר זה הוא הפוטנציאל שלו לשפר את הכנת המתלים של תא בודד על ידי הפחתת הש?...

אנליזה של תא בודד הפכה במהירות לחיונית לתגליות ביו-רפואיות חדשות, בין אם עבור יישומים כגון ציטומטריית זרימה, זיהוי סוגי תאים שונים, ריצוף תא בודד, או לזיהוי שינויים גנומיים או שעתוק בין תאים1. ביצוע בידוד תאים כזה מרקמות מעניינות דורש טחינת רקמות מנותחות ודחיפתן דרך מסננת תאים עדינה כדי לסנן רקמת חיבור מהתאים הרצויים (איור 1A). בידוד סוגי תאים דבקים, כגון תאים דנדריטיים או מקרופאגים, או תאים מרקמות סיביות במיוחד, דורש שלבי הפרדה מכניים או אנזימטיים נוספים 2,3,4. תהליך זה נעשה בדרך כלל באופן ידני, מה שהופך אותו לגוזל זמן רב ונוטה לשונות המשתמש בעת הערכת תפוקת התאים וכדאיות הדגימה. לכן, חיוני להציג אפשרויות הניתנות להתאמה אישית עבור דיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בעוד שנעשו ניסיונות מסוימים לתכנן מערכות כאלה, האפשרויות הקיימות אינן תמיד נגישות, במיוחד במעבדות אקדמיות ובמסגרות דלות משאבים, בעיקר בשל האופי היקר של מכשירים אלה5. יתר על כן, מכשירים אלה אינם תמיד ניתנים להתאמה אישית לצרכים האישיים של קבוצת מחקר6.
כאן, מכשיר דיסוצייאטור רקמות תוכנן כדי להפוך את העיכול של רקמות שלמות או חתיכות רקמה לאוטומטי לתרחיפים חד-תאיים בעזרת אנזימי עיכול ושיבוש מכני. ניתן להרכיב מכשיר זה בקלות במעבדה, להכניס אותו לתאי חימום או קירור לצורך ויסות טמפרטורה, להתאים אותו למספר הרקמות הדרוש לניתוק, ולתכנת אותו עם פרוטוקולי הדיסוציאציה הרצויים. השימוש הנרחב במכשיר זה יכול לשפר באופן משמעותי את יכולת השחזור של פרוטוקולי מיצוי תאים ולספק חלופה חוסכת זמן לדיסוציאציה ידנית.
העיצוב מאפשר עיכול בו זמנית של עד 12 רקמות בתהליך אוטומטי. המכשיר מורכב מ -12 מנועים נפרדים המחוברים במקביל ומופעלים על ידי תקע קיר סטנדרטי באמצעות מתאם AC/DC עם חוגת מתח מתכווננת לשליטה על סיבוב / מהירות המנועים. המנועים מסובבים בורג משושה שמתאים היטב לחלק העליון של צינורות C. צינורות C מוחזקים במקומם על-ידי מתח כלפי מטה על לוח אקרילי שנצמד משני הצדדים ללוח העליון שבו מאובטחים המנועים (איור 1B). מכיוון שהמנועים מחווטים במקביל, מהירותם בכל מתח נתון לא אמורה להשתנות הרבה, אך העומס (מספר צינורות C המותקנים על המכשיר) ישפיע על המהירות גם כאשר המתח נשמר קבוע. כדי למדוד סיבובים לדקה (סל"ד), שולב טכומטר באמצעות חיישן אפקט הול ומגנט קבוע על אחד מפירי המנוע (איור משלים 1). קבצי CAD לבניית מערכים מוטוריים מסופקים בקובץ קידוד משלים 1. כלול גם מתג הניתן לתכנות כדי להפוך את כיוון הסיבוב על ידי היפוך המטענים החיוביים / שליליים המועברים למנועים. כל התכונות הללו משולבות באמצעות תוכנה מקודדת (תוכנת Arduino IDE, ראה טבלת חומרים) על Arduino Nano (קובץ קידוד משלים 2). באמצעות לחצנים מחוברים ופאנל LCD (איור משלים 2), ניתן ליצור ולהריץ פרוטוקולים שמורים ומותאמים אישית, להפוך אוטומטית את כיוון הסיבוב בזמנים מוגדרים של פרוטוקול, להתאים את המהירות באמצעות המתח (איור משלים 3), ולהציג את מהירות המנוע הנוכחית ואת הזמן שנותר להשלמת פרוטוקול מתוכנת (איור משלים 4).
עבור המחקר הנוכחי, תרחיפים חד-תאיים הוכנו באמצעות דיסוציאציה מכנית-אנזימטית של רקמות עם מכשיר זה ודיסוציאציה ידנית-אנזימטית של רקמות כדי לקבוע הבדלים, אם בכלל, בתאים שנמצאו עבור יישומים במורד הזרם. תכשירי התא הוערכו בהתבסס על סך תפוקת התאים לרקמה ואחוז הכדאיות של התא. ציטומטריית זרימה שימשה להשוואת הבדלים פוטנציאליים בביטוי סמן פני השטח. הנתונים נותחו באמצעות תוכנת גרפים וניתוח סטטיסטי. מבחני t וולשיים לא מזווגים שימשו להשוואה בין זוגות דגימות או קבוצות, כאשר גודל הדגימה n > 4 עכברים המייצגים 2 ניסויים משוכפלים. הוראות מפורטות לייצור והרכבה של התקן זה ניתן למצוא בקובץ משלים 1. החומרים הדרושים לפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

היכולת לבודד ולהכין תאים בודדים לניתוח דגימות רקמה הפכה במהירות לחיונית לתגליות ומחקרים ביו-רפואיים חדשים. פרוטוקולים ידניים לבידודים של תא בודד גוזלים זמן רב ומועדים לשונות המשתמש. פרוטוקולים מכניים אוטומטיים מסוגלים להפחית את זמן העיבוד ואת השתנות הדגימה, אך אינם נגישים בקלות או חסכוניים בסביבות מחקר בעלות משאבים נמוכים יותר. המכשיר המתואר כאן תוכנן לדיסוציאציה חצי-אוטומטית של רקמות תוך שימוש בחומרים זמינים מסחרית כחלופה זולה למעבדות אקדמיות. הוראות לייצר, להרכיב ולהפעיל את עיצוב המכשיר סופקו. פרוטוקול הדיסוציאציה מייצר באופן אמין מתלים חד-תאיים עם תפוקת תאים דומה וכדימות דגימה להכנות ידניות על פני רקמות עכבר מרובות. הפרוטוקול מספק את היכולת לעבד עד 12 דגימות רקמה בו זמנית לכל מכשיר, מה שהופך מחקרים הדורשים דגימות גדולות לקלים יותר לניהול. התוכנה הנלווית מאפשרת גם התאמה אישית של פרוטוקול המכשיר כדי להתאים לרקמות משתנות ואילוצים ניסיוניים.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

מחבר זרקור: התקדמות בטכנולוגיית ננו-חלקיקים למתן תרופות ואימונותרפיה

דיסוציאציה מכנית של רקמות לאנליזה של תא בודד באמצעות מכשיר ממונע

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

פרוטוקול מכני חצי-אוטומטי זה יכול לשכפל תוצאות מניסויים שבהם תאים עובדו באופן ידני. תרחיפים של תאים שהוכנו באמצעות המכשיר הזה ובאמצעות דיסוציאציה ידנית מראים תפוקת תאים דומה ויכולת קיום של דגימות ברקמות ריאה, כליות ולב של עכברים (איור 2A,B). אוכלוסיות של תאי חיסון, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

פרוטוקול כללי לדיסוציאציה מכנית אנזימטית ואוטומטית למחצה של רקמות ליצירת מתלים חד-תאיים לאנליזות במורד הזרם, כגון ציטומטריית זרימה, מסופק. הוראות לייצור, הרכבה ותפעול של המכשיר המכני בעלות נמוכה שפותח עבור פרוטוקול זה כלולות.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

המעבדה שלנו מפתחת ננו-חלקיקים ככלים לחקר מחסומים ביולוגיים ולהתגבר על מחסומים אלה על פני רירית כדי לשפר את מתן התרופות ואת האימונותרפיה. אחד הפיתוחים הבולטים ביותר הוא חיסוני הקורונה של פייזר, ביונטק ומודרנה המשתמשים בפורמולציות ננו-חלקיקי שומנים כדי לספק mRNA לחיסון. ישנם מאמצים מתמשכים רבים לשפר אימונותרפיה כמו חיסונים וטיפולים בסרטן באמצעות ננו-חלקיקים, שכן פורמולציות אלה יכולות לשפר את העברת המטרה לתאי החיסון ולהפחית את תופעות הלוואי המערכתיות של אימונותרפיה.אנליזה של תאים בודדים היא מרכיב חיוני באימונולוגיה במחקר ביו-רפואי, אחת הטכניקות הנפוצות ביותר היא ציטומטריית זרימה. ביצוע בידוד תאים כזה מרקמות מעניינות דורש דיסוציאציה אמינה של רקמות. הפיכת מחקר מעבדה לנגיש יותר מבלי להתפשר על איכות ודיוק יכולה להיות מאתגרת.אוטומציה של תהליכים הופכת את השלבים הטכניים ועתירי העבודה לקלים יותר ללמידה ומאפשרת למתאמנים לצבור ניסיון בביצוע ניתוחים מתוחכמים יותר מבלי להשפיע על אמינות התוצאות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה ועיצוב המכשיר הנלווה הוא ההתאמה האישית והחסכוניות שלו. היכולת לעבד עד 12 רקמות בו זמנית מפחיתה את זמני העיבוד.חלופה זולה זו הופכת טכנולוגיה זו לנגישה יותר בהגדרות מחקר בעלות משאבים נמוכים יותר.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

702 Views.  University of Maryland. המעבדה שלנו מפתחת ננו-חלקיקים ככלים לחקר מחסומים ביולוגיים ולהתגבר על מחסומים אלה על פני רירית כדי לשפר את מתן התרופות ואת האימונותרפיה. אחד הפיתוחים הבולטים ביותר הוא חיסוני הקורונה של פייזר, ביונטק ומודרנה המשתמשים בפורמולציות ננו-חלקיקי שומנים כדי לספק mRNA לחיסון. ישנם ...

Video: מחבר זרקור: התקדמות בטכנולוגיית ננו-חלקיקים למתן תרופות ואימונותרפיה

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.