ניתוק מוצלח של כמויות קטנות של רקמות עצביות יכול לצייד את המעבדות כדי לקבל תובנות ספציפיות למבנה לגבי יעילות הטיפול, תפקוד התאים, כמו גם מנגנוני פעולה של מחלות וטיפול. פרוטוקול דיסוציאציה עצבית זה מניב באופן עקבי תרחיף חד-תאי ממשי וממשי ביותר. בנוסף, אנו יכולים לעבד דגימות שהן רק חלק קטן מאלו שהערכות המסחריות מיועדות להן.
תכנון והכנה נכונים הם המפתח לתוצאה מוצלחת עבור טכניקה זו. הפעלת מספר סבבי תרגול כדי להכיר את הפרוטוקול תועיל. לאחר המרדים עכבר C57BL/6J בן שישה חודשים, צובטים את הבטן התחתונה ומרימים את העור באמצעות מלקחיים.
לאחר מכן באמצעות מספריים, לחתוך דרך הפרווה והעור לתחתית הצלעות. בצע שני חתכים אלכסוניים המתחילים מתחת לצלעות ונעים לכיוון כל כתף. לאחר מכן לנתח בזהירות את הסרעפת ואת הצלעות כדי לחשוף את הלב.
לאחר הסרה קפדנית של כל רקמת חיבור סביב הלב, השתמש במספריים כדי לחתוך את האטריום הימני. לאחר מכן כבו את זרימת האיזופלורן אל מכשיר הנשימה. החזקת הלב יציב עם מלקחיים ועם שיפוע מחט הפרפר הפונה כלפי מעלה, חודרים את החדר השמאלי תוך שמירה על רמת המחט ומקבילה לחיה.
לאחר מכן, מחזיקים את המחט במקומה, מפעילים את המשאבה ומנקבים לפחות 30 מיליליטרים של תמיסת המלח או הפרין עד שהנוזל היוצא מהלב אטום והכבד והריאות מחווירים בצבעם. לאחר הזלפה, כבו את המשאבה, הסירו את המחט והעבירו את העכבר לאזור הנתיחה. לאחר העריפה, חתכו את הפרווה מהחלק האחורי של הראש עד לעיניים וקלפו את העור בחזרה כדי לחשוף את הגולגולת.
לאחר מכן, גזרו את הגולגולת בין העיניים ובצעו שני חתכים בחלק האחורי של הגולגולת בתנוחות של 10 ו-2. לאחר מכן בצע חתך אחד ארוך לאורך הקו האמצעי של הגולגולת עד לחתך המקורי בין העיניים. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, לקלף את שני חצאי הגולגולת לצדדים.
לאחר מכן השתמשו במרית כדי להסיר את המוח והניחו אותו בצלחת פטרי 60 מילימטרים מזכוכית מלאה ב-DPBS קר ונשמרת על קרח. באמצעות אזמל או סכין גילוח, להפריד כל חצי כדור ולהסיר את נורות חוש הריח ואת המוח הקטן. לאחר מכן מסירים את המוח האמצעי עד שההיפוקמפוס נחשף.
לאחר מכן, אבטח את המוח עם מלקחיים. לאחר מכן, בעזרת סט שני של מלקחיים, הקניטו בעדינות את ההיפוקמפוס מכל חצי כדור. מעבירים את שני ההיפוקמפי לצינור 1.5 מיליליטר המסומן בכיסא המכיל DPBS קר ומניחים את הצינור על קרח.
באמצעות מלקחיים, מעבירים את חלקי הרקמה של ההיפוקמפי לצינור C ומוסיפים 30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים 2 לצינור. לאחר סיבוב הכובע והידוק עד שהוא לוחץ, מניחים את הצינור בדיסוציאטור ומפעילים את התוכנית המתאימה. בזמן שהתוכנית פועלת, הרטיבו מראש מסננת של 70 מיקרון על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם שני מיליליטרים של מאגר BSA.
לאחר השלמת תוכנית הדיסוציאציה, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של חיץ BSA לרקמה המנותקת וסננו את התערובת דרך מסננת התאים בצינור החרוטי 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטרים של DPBS לצינור C. לאחר מכן סגרו את הצינור, סובבו את התמיסה בעדינות, וסננו אותה דרך מסננת התאים בצינור החרוטי 50 מיליליטר.
צנטריפוגה של תרחיף התא המסונן, השליכו את ה-supernatant מבלי להפריע לכדור ואחסנו את הכדור. להסרת פסולת, יש להחיות את הכדור עם 1, 550 מיקרוליטרים של DPBS קר ולהעביר את ההשעיה לצינור חרוטי מסומן של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 450 מיקרוליטרים של תמיסת הסרת פסולת קרה ופיפטה למעלה ולמטה.
מכסים בעדינות את מתלה התא במיליליטר אחד של DPBS קר, ושומרים את הקצה על דופן הצינור החרוטי. חזור על ההליך עד שהכיסוי הכולל הוא שני מיליליטרים. לאחר מכן, צנטריפוגה המתלים ב 3, 000 פעמים G במשך 10 דקות עם האצה מלאה הפסקה מלאה.
שאפו לשכבה העליונה ביותר, ואז טאטאו את קצה הפיפטה קדימה ואחורה כדי לשאוף לשכבת האמצע הלבנה. הסר כמה שיותר מהשכבה האמצעית מבלי להפריע לשכבה התחתונה ביותר. לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטרים של DPBS קר ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
לאחר מכן צנטריפוגה את המתלים ב 1, 000 פעמים G במשך 10 דקות עם האצה מלאה הפסקה מלאה. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור למאגר BSA מיליליטר אחד. לאחר ספירת התאים, צנטריפוגה של תרחיף התא הנותרת והחזרת הכדור ב-50 מיקרוליטרים של כתם חי מדולל.
לאחר מכן מעבירים את הדגימה לצינור זרימה מסומן ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 8 עד 10 דקות בחושך. לאחר הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר BSA וחזור על שלב הצנטריפוגה. לאחר מכן להשליך את supernatant, משאיר כמות קטנה של חיץ בצינור.
השער הראשי לא כלל פסולת בחלקות הפיזור הקדמי לעומת פיזור הצד, והתאים המתים לא נכללו לאחר מכן. השער השני לא כלל תאים חיוביים לחלבון הבסיסי של המיאלין. ומבין התאים הנותרים נוצרו חלקות צפיפות של תאים חיוביים לכל פלואורוכרום.
התדירות של כל אוכלוסיית תאי עצב חושבה מתוך השער השלישי. דגימות שעובדו עם דיסוציאציה מכנית ידנית ועיכול אנזימטי הניבו אוכלוסייה נמוכה משמעותית של תאים בעלי עניין, בעוד שדגימות טריות וקבועות כאחד שעובדו עם דיסוציאציה מכנית אוטומטית ועיכול אנזימטי הראו אוכלוסייה גבוהה פי כמה של תאים בעלי עניין. בעוד ששלבי הזלוף ופינוי הפסולת יכולים להיות מאתגרים בתחילה, שמירה על יד חלקה ויציבה יכולה לעזור להבטיח הצלחה.
