אנו מודים לקאסל ראלי ב-George Washington University Genomics Core עבור ניתוחי RNA ול-Q2 Lab Solutions עבור ניתוחי ריצוף RNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי [מענק מספר F31NS117085] וקרן המחקר ע"ש ויויאן גיל לד"ר רוברט ה. מילר. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

כל הליכי הטיפול בבעלי חיים והניסויים נערכו לאחר אישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה ומדעי הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון (וושינגטון הבירה, ארה"ב; IACUC #2021-004). המחקר כלל עכברים זכרים ונקבות מסוג C57BL/6J (WT) בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, שמקורם בספק מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו באוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. סקירה כללית של זרימת העבודה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הכנת חוט השדרה
<ol><li>מרדימים את בעלי החיים באמצעות אברטין (12.5 מ"ג/מ"ל של 2,2,2-טריברומואתנול ו-2.5% 2-מתיל-2-בוטנול במים סטריליים) (ראו טבלת חומרים). אשר את היעדר התגובה לצביטות בבוהן ובזנב בעכברים.</li>
	<li>בצע זילוח לב עם מי מלח חוצצים פוספט (DPBS) קר 1x Dulbecco כדי להסיר תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם.<ol><li>מניחים את החיה על מגש רדוד ולבצע חתך לרוחב כדי לחשוף את חלל pleural. הכנס מחט זילוח 23 G המחוברת למשאבה פריסטלטית (ראה טבלת חומרים) לחדר השמאלי והפעל את המשאבה. ברגע DPBS קר זורם דרך הלב, ליצור חתך קטן באטריום הימני. הערה: קצב זילוח מהיר יותר עדיף בשלב זה כדי לשפר את כדאיות התא. יש לשטוף את הדם תוך פחות מדקה. ניקוי הכבד מצביע על זילוח מוצלח.</li>
	</ol></li>
	<li>ערפו את ראשו של בעל החיים באמצעות מספריים גדולים והסירו את עמוד השדרה14. טבלו אותו ב-DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז בצלחת פטרי על קרח לשטיפת רקמות.</li>
	<li>החל מעכשיו, ודא שכל השלבים מתבצעים בסביבה סטרילית. השתמש בשחול הידראולי14 כדי לבודד את חוט השדרה כולו. השתמש במחט 18 גרם ומזרק 10 מ"ל מלא DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז. העבירו את חוט השדרה לצלוחית פטרי המונחת על שקיות קרח המכילות מספיק DPBS קר 1x עם Ca2+/Mg2+/0.2% גלוקוז כדי לטבול את הרקמה כולה.</li>
	<li>בזהירות להסיר את קרומי המוח תחת מיקרוסקופ בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית. מעבירים את חוט השדרה לצלחת פטרי ריקה על חבילות קרח, ובאמצעות אזמל כירורגי מס '10 להב, חותכים את חוט השדרה כולו למקטעים של 2-3 מ"מ.</li>
</ol>2. דיסוציאציה אנזימטית של תאים
<ol><li>הוסף תערובת אנזימים 1 ותערובת אנזימים 2 מערכת הדיסוציאציה המוחית למבוגרים הזמינה באופן מסחרי בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). מערבלים את האנזימים בצלחת מספר פעמים כדי להבטיח ציפוי אחיד של חוט השדרה, ואז דוגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. כל 5 דקות, מערבלים בעדינות את המנה כדי למנוע גושי רקמות ולהקל על הפצה אחידה של ריאגנטים.</li>
	<li>מוציאים את הצלוחית מהאינקובטור ומוסיפים 350 μL של 0.46 מ"ג/מ"ל DNAse I ב-Minimal Essential Medium (MEM) (ראה טבלת חומרים). מערבבים בעדינות.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל של DMEM קר/סרום בקר עוברי 0.5% (FBS) ולערבב בעדינות. מיד להעביר את התוכן כולו לצינור 5 מ"ל.</li>
</ol>3. דיסוציאציה מכנית של תאים
<ol><li>באמצעות פיפטה P1000, Triturate בעדינות את הרקמה שלוש פעמים, להבטיח כי חתיכות רקמה נמשכים בכל פעם כדי לנתק עוד יותר את הרקמה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית 9 אינץ' מחוברת, טרטור בעדינות חמש פעמים נוספות, כדי להבטיח שלא ייווצרו בועות במהלך התהליך.</li>
	<li>מניחים את הצינור 5 מ"ל זקוף ומאפשרים לרקמה להתיישב בתחתית במשך 30 שניות. לאחר שהרקמה התיישבה, ציירו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה P1000 והעבירו אותו דרך מסנן של 30 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.</li>
	<li>לאותו צינור 5 מ"ל עם הרקמה הנותרת, הוסף 1 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS. בעזרת פיפטה של פסטר, טריטורט בעדינות שלוש פעמים.</li>
	<li>תנו לרקמה לשקוע בתחתית למשך 30 שניות, ואז העבירו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 30 מיקרומטר ואספו אותו לאותו צינור של 15 מ"ל כמו קודם. חזור על שלב 3.3 ושלב 3.4 פעם נוספת.</li>
	<li>צנטריפוגה את מתלה התא המסונן ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant שנוצר באמצעות שואב ואקום.</li>
</ol>4. הסרת מיאלין
<ol><li>הסר את המיאלין באמצעות הפתרון להסרת פסולת (DRS) המסופק בערכת דיסוציאציה מוחית למבוגרים בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר הסרת הפסולת, הוסף 5 מ"ל של DMEM קר / 0.5% FBS לגלולת התא והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: אם התאים ישמשו למחקרי מבחנה ויישארו בתרבית, יש להשתמש במקום זאת ב- DMEM / 0.5% FBS שחומם מראש.</li>
	<li>יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של DPBS/0.5% FBS (קר למחקרי RNA וחם לבדיקות במבחנה ). ספרו את התאים והעריכו את הכדאיות באמצעות Trypan Blue. הערה: ניתן לשלב תרחיפים של תאים מבעלי חיים מרובים כדי להגדיל את ריכוז התאים.</li>
	<li>שטף את התאים על-ידי הוספת DPBS/0.5% FBS עד לנפח כולל של 5 מ"ל. צנטריפוגו את המתלים ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה.</li>
</ol>5. בידוד מיקרוגליה ואסטרוציטים
<ol><li>תייג את התאים עם מיקרו-כדוריות אנטי-CD11b או אנטי-ACSA-2 בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>מיין את התאים לפי בחירה חיובית באמצעות עמודות MS בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). לאחר המיון, צנטריפוגו את התאים הממוינים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ולזרוק את supernatant.</li>
</ol>6. ציפוי תאים לבדיקות חוץ גופיות
הערה: אם התאים לא יהיו מצופים וישמשו באופן מיידי לניתוח RNA, המשך לשלב 8.
<ol><li>להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של DMEM חם / 0.5% FBS. ספרו את התאים והעריכו את יכולת הקיום שלהם באמצעות המציטומטר (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>כוונן את ריכוז התא ל- 75,000 תאים לכל 50 מיקרוליטר. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל כיסוי מצופה פולי-L-ליזין11 בצלחת של 24 בארות.</li>
	<li>יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להיצמד לכיסוי.</li>
	<li>יש להוסיף בזהירות 450 μL של DMEM חם/5% FBS/פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep, ראו טבלת חומרים) לכל באר.</li>
	<li>לאחר 3 ימים, החלף מחצית מהמדיה ב- 250 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep. לתחזוקה, החלף לחלוטין את המדיה עם 500 μL של DMEM חם / 5% FBS / Pen-Strep כל 4-5 ימים.</li>
</ol>7. אימונוהיסטוכימיה
הערה: עדיף לבצע ניתוחים אימונוהיסטוכימיים לאחר 3 ימים לפחות כאשר המדיה הוחלפה לפחות פעם אחת. זה מבטיח שהפסולת הוסרה והתאים נדבקו לחלוטין לכיסוי.
<ol><li>הסר את המדיה ותייג את התאים עם mAb O4 נגד עכבר (1:100) (ראה טבלת חומרים) בסרום DMEM חם/5% FBS/10% רגיל של עזים (NGS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או ב-37°C. הערה: דלג על שלב זה והמשך לשלב 7.3 אם התאים לא יסומנו ב- O4.</li>
	<li>שטפו בעדינות את הכיסויים על ידי טבילתם ב-DMEM/5% FBS חם שלוש פעמים. הוסף עז נגד עכבר 594 IgM (1: 300) (ראה רשימת חומרים) ב- DMEM חם / 5% FBS / 10% NGS ודגור ב- RT במשך 15 דקות בחושך. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים ב-DMEM חם/FBS 5%.</li>
	<li>תקן את התאים עם 5% חומצה אצטית / מתנול קר במשך 15 דקות ב 4 ° C. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתייג עם הנוגדן המתאים: GFAP נגד ארנבים (1: 500), GFAP נגד עכבר (1: 500), או נגד ארנב Iba1 (1: 500) ב 1% Triton-X100/10% NGS ב 1x DPBS (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך שעה אחת ב- RT. הערה: יש לשמור את הכיסויים בחושך אם הם כבר הוכתמו ב-O4.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. תווית עם הנוגדן המשני המתאים: נגד עכבר 594 IgG (1: 500), נגד ארנב 488 IgG (1: 500) (ראה טבלת חומרים). דגירה במשך 30 דקות ב- RT בחושך.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS. כתם נגדי עם DAPI (1:1000) למשך דקה אחת ב-RT. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להוסיף אמצעי הרכבה (ראו טבלת חומרים) ולהרכיב כיסויים על שקופיות.</li>
</ol>8. מיצוי RNA
הערה: באופן אידיאלי, צריכים להיות לפחות 100,000 תאים כדי לחלץ מספיק RNA לניתוח. במידת הצורך, ניתן לשלב תאים מ 2-3 חוטי שדרה.
<ol><li>חלץ RNA באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). עבור כל שלב שטיפה עם חיץ הכביסה RW1 המסופק בערכה, השאירו את התאים במאגר הכביסה למשך 2 דקות נוספות.</li>
	<li>הסר את כל הדנ"א הגנומי שנותר באמצעות DNase I בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). יש לדגור עם DNase ב-RT למשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם חיץ RW1.</li>
	<li>כדי להגדיל את תפוקת הרנ"א, לפני ההדבקה, יש לדגור על הדגימות במים נטולי RNAse ב-RT למשך 10 דקות. להעריך את שלמות הרנ"א ואת כמותו, באמצעות ביואנלייזר15 (ראה טבלת חומרים).</li>
</ol>

חילוץ יעיל של אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר

<ol>
	<li>Abbott, N. J., R&#246;nnb&#228;ck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain.">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li><li>Badimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+feedback+control+of+neuronal+activity+by+microglia.">Negative feedback control of neuronal activity by microglia.</a> Nature. 586, 417-423 (2020).</li><li>Yanuck, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+neurons:+diminishing+neuronal+loss+in+traumatic,+infectious,+inflammatory,+and+autoimmune+CNS+disorders.">Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders.</a> Front Psychiatry. 10, 712 (2019).</li><li>Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypic+diversity+of+microglia:+implication+for+microglia-based+therapies+for+alzheimer&#8217;s+disease.">Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer&#8217;s disease.</a> Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).</li><li>Song, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial-oligodendrocyte+interactions+in+myelination+and+neurological+function+recovery+after+traumatic+brain+injury.">Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).</li><li>Butler, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+of+neurons+in+neurodegeneration,+and+its+regulation.">Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation.</a> J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).</li><li>Voskuhl, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+astrocytes+form+scar-like+perivascular+barriers+to+leukocytes+during+adaptive+immune+inflammation+of+the+CNS.">Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS.</a> J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).</li><li>Bordon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFG+activity+in+astrocytes+drives+CNS+inflammation.">MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).</li><li>Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+downstream+characterization+of+primary+microglia+and+astrocytes+from+adult+rodent+brain+and+spinal+cord.">Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).</li><li>Kerstetter, A. E., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+spinal+cord+astrocytes.">Isolation and culture of spinal cord astrocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).</li><li>Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+direct+neuronal+reprogramming+of+mouse+astrocytes.">Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes.</a> J Vis Exp. (185), 64175 (2022).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydraulic+extrusion+of+the+spinal+cord+and+isolation+of+dorsal+root+ganglia+in+rodents.">Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents.</a> J Vis Exp. (119), e55226 (2017).</li><li>Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioanalyzer+chips+can+be+used+interchangeably+for+many+analyses+of+DNA+or+RNA.">Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA.</a> Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).</li><li>Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+isolation+of+primary+astrocytes+and+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).</li><li>Pan, J., Wan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+comparison+of+FACS+and+MACS+isolation+of+enriched+microglia+and+astrocytes+from+mouse+brain.">Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain.</a> J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).</li><li>Neuschulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+RNA+labeling+strategy+for+measuring+stress+response+upon+tissue+dissociation.">A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation.</a> Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).</li><li>CB, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+brain-all+cells:+a+comprehensive+protocol+to+isolate+all+principal+cns-resident+cell+types+from+brain+and+spinal+cord+of+adult+healthy+and+EAE+mice.">One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice.</a> Cells. 10 (3), 1-25 (2021).</li></ol>

ללא

הבידוד של תאים ראשוניים טהורים וברי קיימא הוא בעל חשיבות עליונה לחקר המבנה והתפקוד של סוגי תאים ספציפיים. בעכבר בוגר, במיוחד בחוט השדרה, משימה זו מציבה אתגרים משמעותיים, מכיוון שהפרוטוקולים הקיימים לרוב אינם מותאמים לחוט השדרה הבוגר10,17. פרוטוקול זה מציג שי?...

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה הם תאי גלייה רב-תכליתיים הממלאים תפקידים חיוניים במערכת העצבים המרכזית (CNS), וכוללים תחומי אחריות כגון ויסות התפקוד העצבי, תרומה להתפתחות מערכת העצבים המרכזית, שמירה על מחסום הדם-מוח והשתתפות בתהליכים קריטיים אחרים 1,2,3,4 . מלבד תפקידם בשמירה על הומאוסטזיס, תאי גלייה אלה ממלאים גם תפקיד מרכזי במנגנוני פציעה ותיקון. תאי מיקרוגליה ידועים ביכולות הפאגוציטיות, הדלקתיות והנדידה שלהם בעקבות עלבונות או פציעות 5,6,7. תגובות אסטרוציטים במחלות מגוונות באותה מידה, וכוללות תרומות לדלקת, להיווצרות צלקות גלייה ולפשרה של מחסום הדם-מוח 8,9. למרות שהבנתנו את התפקידים המזיקים והמשניים של מיקרוגליה ואסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית גדלה, ההטרוגניות המובנית הן במבנה והן בתפקוד שלהם מחייבת כלים חזקים לחקור אותם בהקשרים שונים.
השגת תובנה נוספת לגבי תפקידם של מיקרוגליה ואסטרוציטים בבריאות ובמחלות דורשת גישה משולבת של חקירות in vivo ו - in vitro . טכניקות In vivo ממנפות את האינטראקציה המורכבת בין תאי גלייה ונוירונים בתוך מערכת העצבים המרכזית, בעוד שמתודולוגיות in vitro מוכיחות ערך בעת הערכת תפקודים או תגובות של תא בודד תחת גירויים ספציפיים. כל שיטה מציעה יתרונות ייחודיים; מחקרי מבחנה חיוניים להבנת התפקידים הספציפיים של סוגי תאים אלה ללא קלט ישיר או עקיף מתאים שכנים. בנוסף, בדיקות במבחנה המשתמשות בקווי תאים בני אלמוות מציגות יתרונות מסוימים, כולל היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן, יעילות כלכלית וקלות תחזוקה. עם זאת, חשוב לציין כי תאים ראשוניים מחקים באופן הדוק יותר תגובות פיזיולוגיות נורמליות בהשוואה לקווי תאים. רלוונטיות פיזיולוגית זו חיונית בבדיקות תפקודיות ובניתוחים תעתיקים.
אחד האתגרים בהשגת תאים ראשוניים, במיוחד מחוט השדרה של עכבר בוגר, טמון בכמות ובכדאיות הדגימות. חוט השדרה הבוגר, בהיותו קטן יותר מהמוח ומכיל כמות משמעותית של מיאלין, מציב קשיים ייחודיים. בעוד שישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו המפרטים את הבידוד של תאי גלייה טהורים וברי קיימא מבעלי חיים בילודים או ממוח העכבר הבוגר 10,11,12,13, מתודולוגיות אלה עשויות שלא להתאים לחקר מחלות ופציעות ספציפיות לחוט השדרה. בפרוטוקול זה, אנו מציעים הליך מקיף לבידוד יעיל של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, מה שמקל על יישומים במורד הזרם בתרביות תאים ובניתוחי שעתוק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבידוד תאים אלה מעכברים בוגרים בגילאי 10 שבועות עד 5 חודשים, והדגים את יעילותו בהקשרים שונים, כולל מחקרים שכללו עכברי נוקאאוט מותנה, תגובות לתרופות, מחקר התפתחותי ומודלים הקשורים לגיל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well tissue culture plate</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>10861-558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol, 98%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A18304-0F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45% glucose solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-037-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL capped tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Adlrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>103-107-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA2 Microbead Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-097-679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type (WT) mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b (Microglia) MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltrics 30 &#181;m filter</td>
			<td>Sysmex Partec</td>
			<td>04-004-2326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber (Hemacytometer)</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4527-40KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>TMO</td>
			<td>15230001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase for RNA purification</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A5209401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody (mouse)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-33673</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody (rabbit)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 594 IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>a11032</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 594 IgM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>a21044</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit 488 IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>a11008</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 antibody (rabbit)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-1974</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C/L Pump System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>77122-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Adlrich</td>
			<td>439193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plugged 9&#34; glass pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>22-079-683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm</td>
			<td>Kawasumi</td>
			<td>D3K2-23G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pure astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord for in vitro assays and transcriptomic studies

אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית, תגובות פציעה ומחלות נוירודגנרטיביות. תאים דינמיים מאוד אלה מפגינים תגובות מהירות לשינויים סביבתיים ומפגינים הטרוגניות משמעותית במונחים של מורפולוגיה, פרופילי שעתוק ופונקציות. בעוד שהבנתנו את תפקודם של תאי גלייה בבריאות ובמחלות התקדמה באופן משמעותי, עדיין יש צורך בניתוחים חוץ-גופיים, ספציפיים לתאים שנערכו בהקשר של עלבונות או פציעות כדי לאפיין באופן מקיף אוכלוסיות תאים נפרדות. בידוד תאים מהעכבר הבוגר מציע מספר יתרונות על פני קווי תאים או בעלי חיים בילוד, שכן הוא מאפשר ניתוח של תאים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות. יתר על כן, התמקדות בבידוד ספציפי לחוט השדרה, למעט מעורבות מוחית, מאפשרת מחקר על פתולוגיות של חוט השדרה, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, פגיעה בחוט השדרה וטרשת אמיוטרופית צידית. פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה לבידוד אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומאפשר ניתוח מיידי או עתידי עם יישומים פוטנציאליים במחקרים פונקציונליים, מולקולריים או פרוטאומיים במורד הזרם.

Astrocytes and microglia are versatile glial cells that play vital roles in the central nervous system (CNS), encompassing responsibilities such as regulating neuronal function, contributing to CNS development, maintaining the blood-brain barrier, and participating in other critical processes1,2,3,4. Besides their role in maintaining homeostasis, these glial cells also play a pivotal part in injury and repair mechanisms. Microglia are well-known for their phagocytic, inflammatory, and migratory capabilities following insults or injuries5,6,7. Astrocyte responses in disease are equally diverse, encompassing contributions to inflammation, the formation of glial scars, and the compromise of the blood-brain barrier8,9. Although our understanding of the detrimental and reparative roles of microglia and astrocytes in the CNS has grown, the inherent heterogeneity in both their structure and function necessitates robust tools for studying them in various contexts.
Gaining further insight into the roles of microglia and astrocytes in health and disease requires a combined approach of in vivo and in vitro investigations. In vivo techniques leverage the intricate crosstalk between glial cells and neurons within the CNS, while in vitro methodologies prove valuable when assessing single-cell functions or responses under specific stimuli. Each method offers unique advantages; in vitro studies are essential for understanding the specific roles of these cell types without direct or indirect input from neighboring cells. Additionally, in vitro assays utilizing immortal cell lines present certain benefits, including the ability to proliferate indefinitely, cost-efficiency, and ease of maintenance. However, it&#39;s important to note that primary cells more closely mimic normal physiological responses compared to cell lines. This physiological relevance is crucial in functional assays and transcriptomic analyses.
One of the challenges in obtaining primary cells, particularly from the adult mouse spinal cord, lies in the quantity and viability of the samples. The adult spinal cord, being smaller than the brain and containing a significant amount of myelin, poses unique difficulties. While there are several published protocols detailing the isolation of pure, viable glial cells from neonatal animals or the adult mouse brain10,11,12,13, these methodologies may not be suitable for studying diseases and injuries specific to the spinal cord. In this protocol, we offer a comprehensive procedure to efficiently isolate pure, viable microglia and astrocytes from the adult mouse spinal cord, facilitating downstream applications in cell culture and transcriptomic analyses. This protocol has been successfully employed to isolate these cells from adult mice aged 10 weeks to 5 months, demonstrating its utility across various contexts, including studies involving conditional knockout mice, drug responses, developmental research, and age-related models.

מחבר זרקור: בידוד תאי גליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר 

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

Our research aims to characterize specific cell populations in the central nervous system, specifically the spinal cord, using preclinical models of disease. And we are trying to determine how these cells are affected under pathological conditions and at different time points. It can be challenging to analyze cells, especially in the central nervous system because the cells in the brain and spinal cord form a highly complex matrix and everything is very tightly connected, so it can be difficult to isolate these cells without damaging the system.Our protocol addresses limitations in existing methods for studying spinal cord diseases by efficiently isolating viable microglia astrocytes from the small myelin-rich adult mouse spinal cord. This enables in vitro research on spinal cord related diseases in downstream analysis, filling a crucial research gap. This protocol presents several advantages such as analyzing astrocytes and microglia under pathological conditions and at specific time points.It also uniquely focuses on isolating glial cells from this adult spinal cord alone, excluding brain involvement. This allows researchers to study spinal cord pathologies at the cellular level.

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות בידוד של מיקרוגליה ואסטרוציטים טהורים וברי קיימא מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקלות על יישומים שונים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות או היסטולוגיות במבחנה וניתוח RNA.
בידוד מוצלח למחקרי מבחנה יביא להתרבות תאים רציפה במשך מ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glial Cells from the Adult Mouse Spinal Cord at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

מטרת המחקר שלנו היא לאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות במערכת העצבים המרכזית, ובפרט בחוט השדרה, באמצעות מודלים פרה-קליניים של מחלות. ואנחנו מנסים לקבוע כיצד תאים אלה מושפעים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן שונות. זה יכול להיות מאתגר לנתח תאים, במיוחד במערכת העצבים המרכזית מכיוון שהתאים במוח ובחוט השדרה יוצרים מטריצה מורכבת מאוד והכל מחובר בצורה הדוקה מאוד, כך שיכול להיות קשה לבודד תאים אלה מבלי לפגוע במערכת.הפרוטוקול שלנו מטפל במגבלות בשיטות הקיימות לחקר מחלות חוט השדרה על ידי בידוד יעיל של אסטרוציטים של מיקרוגליה בת קיימא מחוט השדרה של עכבר בוגר קטן עשיר במיאלין. זה מאפשר מחקר חוץ גופי על מחלות הקשורות לחוט השדרה בניתוח במורד הזרם, וממלא פער מחקרי מכריע. פרוטוקול זה מציג מספר יתרונות כגון ניתוח אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן ספציפיות.הוא גם מתמקד באופן ייחודי בבידוד תאי גלייה מחוט השדרה הבוגר הזה בלבד, למעט מעורבות מוחית. זה מאפשר לחוקרים לחקור פתולוגיות חוט השדרה ברמה התאית.

isolation-pure-astrocytes-microglia-from-adult-mouse-spinal-cord-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

1.2K Views.  The George Washington University School of Medicine. מטרת המחקר שלנו היא לאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות במערכת העצבים המרכזית, ובפרט בחוט השדרה, באמצעות מודלים פרה-קליניים של מחלות. ואנחנו מנסים לקבוע כיצד תאים אלה מושפעים בתנאים פתולוגיים ובנקודות זמן שונות. זה יכול להיות מאתגר לנתח תאים, במיוחד במערכת העצבים המרכזית מכיוו...

Video: מחבר זרקור: בידוד תאי גליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר 

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Astrocyte and Microglial Cell Isolation from the Adult Mouse Spinal Cord

To begin, remove the spinal cord of a decapitated mouse that has been perfused with PBS. Submerge the spinal cord in cold DPBS in a Petri dish on ice. With an 18-gauge needle and a 10-milliliter syringe filled with cold DPBS, use hydraulic extrusion to isolate the entire spinal cord in a laminar flow hood.Transfer the spinal cord into Petri dish with cold DPBS placed on ice packs. Using a microscope inside the laminar flow hood, carefully remove any visible meninges with sharp forceps. Then, transfer the spinal cord to an empty Petri dish and use a No.10 surgical scalpel blade to cut it into two to three-millimeter-long sections.For enzymatic dissociation of the spinal cells, add Enzyme Mixes 1 and 2 to the spinal cord pieces. Swirl the enzymes in the dish several times to ensure uniform coating of the spinal cord. Incubate the dish at 37 degrees Celsius for 30 minutes, manually swirling the dish every 10 minutes.After incubation, add 350 microliters of DNAse I.Swirl the dish gently to mix. Next, add one milliliter of cold DMEM supplemented with 0.5%FBS before gently mixing. Immediately transfer the entire contents to a five-milliliter tube.With a P1000 pipette, gently triturate the tissue three times. Then, use a plugged nine-inch glass Pasteur pipette to gently triturate the tissue five more times. Place the tube upright for 30 seconds to allow the tissue to settle.With a P1000 pipette, aspirate out the supernatant and transfer it through a 30-micrometer filter into a 15-milliliter conical tube. To the tube with the remaining tissues, add one milliliter of FBS-supplemented DMEM. Then, gently triturate three times with a Pasteur pipette.After letting the tissue settle at the bottom, pass the supernatant through a 30-micrometer filter and collect it into the same 15-milliliter tube used earlier. Centrifuge the filtered cell suspension at 300 g for 10 minutes at room temperature. Use a vacuum aspirator to carefully discard the supernatant.Use the debris removal solution provided in the adult brain dissociation kit to remove the myelin from the cell pellet. Then, add five milliliters of FBS-supplemented DMEM to the pellet and gently invert the tube three times to mix. After centrifuging, discard the supernatant and resuspend the cell pellet in one milliliter of FBS-supplemented DPBS.Centrifuge again before discarding the supernatant. Labeled the cells with Anti-ACSA-2 MicroBeads following the manufacturer's protocol. Use the magnetic separation columns to separate the cells by positive selection.Then, centrifuge the cells at 300 g for 10 minutes before discarding the supernatant. Next, resuspend the cell pellet in one milliliter of warm FBS-supplemented DMEM. Transfer the cell suspension to a hemocytometer to count the cells and assess their viability.Adjust the cell concentration to 75, 000 cells per 50 microliters with FBS DMEM. Then, transfer 50 microliters of the cell suspension to a poly-l-lysine-coated coverslip in a 24-well plate. Incubate the plate at 37 degrees Celsius for two hours to allow the cells to adhere to the coverslip.Then, carefully add 450 microliters of warm and antibiotic-supplemented FBS DMEM to each well. Successful isolation and proliferation of microglia and astrocytes were observed. By day four, astrocytes were observed to form longer processes, while oval microglial cells with shorter spindles were seen.The astrocytes formed a connected confluent layer by day seven, with the microglia displaying fewer and shorter processes. Cell sorting confirmed 92 to 93%cell viability of the isolated cell culture.