אנו מכירים בשימוש במתקן הליבה התאית והמולקולרית באוניברסיטת מידווסטרן.

הקמת מונולייר דו-ממדי מתרבית אנטרואידית אילית בקר תלת מימדית

<ol>
	<li>Gerdts, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing.">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li><li>Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+human+disease.">Animal models for human disease.</a> Animal Biotechnology. Chapter 8, 153-171 (2020).</li><li>Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+use+of+animal+models+to+advance+scientific+research.">Innovative use of animal models to advance scientific research.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).</li><li>Hamernik, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+animals+are+important+biomedical+models.">Farm animals are important biomedical models.</a> Animal Frontiers. 9 (3), (2019).</li><li>Ribitsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering:+To+do+or+not+to+do.">Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).</li><li>Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+model+systems+and+tools+for+basic+and+translational+human+immunology.">Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology.</a> Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Roth, J. A., Tuggle, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+models+in+translational+medicine.">Livestock models in translational medicine.</a> ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).</li><li>Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+bovine+immune+response.">Ontogeny of the bovine immune response.</a> Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).</li><li>Potter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing.">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li><li>Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., &#214;hman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+system+of+the+gastrointestinal+tract:+maintaining+balance+between+the+good+and+the+bad.">Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+Study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D-+and+3D-based+intestinal+stem+cell+cultures+for+personalized+medicine.">2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine.</a> Cells. 7 (12), 225 (2018).</li><li>Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+-+New+models+for+host-helminth+interactions.">Organoids - New models for host-helminth interactions.</a> Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).</li><li>Hamilton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vitro+enteroids+derived+from+bovine+small+intestinal+crypts.">Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts.</a> Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+three-dimensional+(3D)+expansion+of+bovine+intestinal+organoids:+An+in+vitro+model+as+a+potential+alternative+to+an+in+vivo+system.">Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).</li><li>T&#246;pfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+colon+organoids:+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms.">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical,+biomolecular+and+biochemical+characterization+of+bovine+epithelial+intestinal+primocultures.">Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.</a> BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).</li><li>Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-vitro+model+for+studying+the+interaction+of+Escherichia+coli+O157:H7+and+other+enteropathogens+with+bovine+primary+cell+cultures.">An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li><li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+host-pathogen+interactions+in+the+context+of+the+microenvironment:+Three-dimensional+cell+culture+comes+of+age.">Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).</li><li>Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cattle+breed+and+basal+diet+on+digestibility,+rumen+bacterial+communities,+and+eating+and+rumination+activity.">Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity.</a> Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization.">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר מודל פיזיולוגי רלוונטי לחקירת פיזיולוגיה של המעי והפרעות אנטריות. מספר קבוצות מחקר תיארו את הדור של תרביות אנטרואידים של בקר, כולל חד-שכבות דו-ממדיות 16,19,20,21,22,23,24. בעוד שיצירת חד-שכבות אינה מאתגרת מבחינה טכנית באופן גלוי, כמה צעדים זעירים הם קריטיים בפיתוח תרבויות מוצלחות באופן עקבי. ככזה, יכולת השחזור של חד-שכבות דו-ממדיות באמצעות השיטות המתוארות בקצרה בספרות שפורסמה יכולה להיות מאתגרת עבור חוקר טירון בתחום האורגנואידים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם מפרוטוקולים אלה ומאלו שפורסמו במינים אחרים, ומספק מדריך שלב אחר שלב ליצירת חד-שכבות על תוספות טרנסוול הניתנות לשחזור ברמה גבוהה.
ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקול המתואר כאן כך שיתאים למטרות הספציפיות של תכנון הניסוי או לזמינותם של ריאגנטים. ואכן, בעקבות פרוטוקול זה, תרביות מוצלחות יכולות להיות מושגות על ידי זריעת חד-שכבות בצפיפות תאים נמוכה יותר (למשל, 2.5 x 104) או בהיעדר FBS, כפי שמתואר בפרסומים אחרים24. עם זאת, שינוי פרמטרים אלה עשוי לדרוש תרבות מוגברת כדי ליצור monolayer confluent. לפיכך, אם גורמים אחרים המהווים חלק בלתי נפרד מתכנון המחקר, כולל תרבית משותפת עם תאי מערכת החיסון, מכתיבים מסלול זמן מסוים לניסוי, ניתן לשנות את צפיפות הזריעה לפי הצורך. בעוד שפורמולציות אחרות של קרום מרתף יכולות להיות מוחלפות במקום זו המשמשת בפרוטוקול זה ליצירת אנטרואידים תלת-ממדיים וחד-שכבות דו-ממדיות, אלה ידרשו אופטימיזציה מסוימת כדי לקבוע את היחס האופטימלי בין קרום המרתף למדיה.
ליישום של תוספות טרנסוול במתודולוגיה המתוארת יש יתרונות רבים על פני גידול monolayer על כלי פלסטיק קונבנציונאלי תרביות אנטרואידים 3D. בהשוואה ללוחות תרבית רקמה סטנדרטיים, שימוש בטרנסוולים לתרביות חד-שכבתיות מקדם התמיינות וארגון תאים באופן השומר על מראית עין של קריפטים במעיים14,25. מחסום אפיתל המעי חיוני במניעת טרנסלוקציה של רעלים ומיקרואורגניזמים לגוף ובו זמנית להקל על ספיגת חומרים מזינים. לכן, חשוב להבין כיצד שלמות המחסום של המעי מתפקדת במצב בריא ומשתנה במהלך הפרעות מעיים או בתגובה לתרכובות. שלא כמו תרביות אנטרואידים תלת-ממדיות, הערכה אובייקטיבית של שלמות מחסום המעי אפשרית כאשר משלבים חד-שכבות על טרנסוולים ומודדים TEER, כפי שמוצג כאן14,25. יצירת חד-שכבות דו-ממדיות על טרנסוולים מאפשרת גם תרבית כפולה עם סוגי תאים רלוונטיים כגון תאי חיסון או סטרומה. זה מאפשר לאפיין יחסי גומלין בעלי חשיבות קריטית בין תאי המעי לבין תאי המיקרו-סביבה של הרקמה, דבר שלא ניתן להשיג באמצעות תרביות תלת-ממדיות. חשיפת פני השטח האפיקליים של החד-שכבה לא רק מאפשרת חשיפה ניסיונית לפתוגנים ולתרכובות ואיסוף תוצרים לומינליים, אלא גם מאפשרת מחקרים על היבטים אחרים של פיזיולוגיה ומחלות של המעי, כולל חקירת מיקרוביוטה של המעי ופיזיולוגיה מולקולרית של ספיגה או הובלה13. שליטה עצמאית על משטחי המעי האפי והבסיסי היא יתרון מובהק על פני מודלים אנטרואידים תלת ממדיים.
באמצעות מספר ניסויים, זיהינו שלבים מרכזיים שתרמו להצלחת הפרוטוקול. בעוד דגימות רקמת מעי שלמות ניתן לשמור בקירור במשך הלילה ולעבד למחרת, דיסוציאציה רקמות ובידוד של שלבי מקטע קריפטה חייב להתבצע מיד כדי למנוע את ההתפוררות של שברי הקריפטה המבודדים. לאחר השלמת שטיפות PBS, צנטריפוגה של הקריפטות ב-Wash Media יכולה לסייע במניעת התמוטטות הקריפטה, כמפורט בשלב 2.3.10. כאשר עוברים את האנטרואידים או קוצרים אותם להיווצרות monolayer, חיוני להפריד את enteroids מן הכיפות BME. מדיית הכביסה חייבת להיות קרה כקרח כדי לסייע בהמסת ה-BME. לעומת זאת, שימוש ב-TrypLE שחומם מראש וסינון תרחיף התא פעמיים יכולים לעזור ליצור את התאים הבודדים הדרושים ליצירת חד-שכבתיות. לבסוף, תמרון ידני של הצלחת בצורת הספרה 8 יכול לעזור לפזר באופן שווה את התאים הבודדים על פני החדרת הטרנסוול.
מגבלה חשובה של פרוטוקול זה היא שהחד-שכבות הדו-ממדיות הופקו ממלאי אנטרואידים שנוצרו מהגה הולשטיין בוגר (>2 שנים). הבשלת מערכת העיכול בשוקיים עשויה לדרוש שינויים קלים בפרוטוקול המתואר כדי להניב תוצאות מיטביות. הבדלים ספציפיים לגזע בפיזיולוגיה של המעי של גזעי בקר תוארו בספרות26. אמנם לא ידוע אם הבדלים אלה יכולים להשפיע על אנטרואידים ועל יצירת מונושכבות לאחר מכן, אך אנו חושדים שכל הבדל יגרום לשינויים קלים בלבד בפרוטוקול שלנו. בנוסף, למודל התרבות הדו-ממדית יש כמה חסרונות מובנים. בהשוואה למודלים אנטרואידים תלת-ממדיים, תרביות דו-ממדיות עשויות להיות חסרות היבטים מסוימים של ארכיטקטורת רקמת המעי והמגוון התאי וליצור מגבלות ואתגרים הקשורים להתפשטות תרבית דו-ממדית13. עם זאת, מחקרים מראים כי חלק מהחד-שכבות יכולות לחקות את ארגון הקריפטההצפוי 27, ועל חלק מהמגבלות הללו ניתן אפילו להתגבר על ידי הקמת תרבויות דו-ממדיות עם ממשק אוויר-נוזל. עם זאת, יש לשקול במלואן את מגבלותיו של מודל זה כדי לקבוע אם יישומו מתאים לשאלה הניסויית הנשאלת.
פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבית אופטימלית המדמה את מערכת העיכול של בקר באמצעות אנטרואידים שמקורם באילאום הבקר ליצירת מונושכבות על תוספות טרנסוול. עם מגוון רחב של יישומים, החל ממחקר מחלות זיהומיות ועד גילוי תרופות ורפואה רגנרטיבית, מערכת תרביות בעלת תפוקה גבוהה זו יכולה להוביל לפיתוח חסר תקדים של אסטרטגיות מניעה וטיפול שיכולות להועיל הדדית לבריאות בעלי חיים ובני אדם.

מודלים של בעלי חיים במחקר ממלאים תפקיד מכריע בשיפור ההבנה שלנו של פתופיזיולוגיה של מחלות והדינמיקה של התגובה החיסונית של המאכסן במהלך זיהום ותומכים בפיתוח אסטרטגיות מניעה וטיפול חדשניות 1,2,3,4. מודלים אלה תומכים בגילוי וקידום מחקרים בבעלי חיים והם המפתח להתקדמות המחקר בתחום בריאות האדם. במשך עשרות שנים, מודלים של מכרסמים עמדו בבסיס התקדמות במנגנוני החיסון ומחקר ביולוגי בסיסי למחלות אנושיות 3,5,6,7. בעוד מודלים של מכרסמים הם קריטיים בסינון ובמחקר התפתחות מוקדמת, מודלים של בעלי חיים גדולים מציעים השוואה רלוונטית יותר בחקר מחלות אנושיות הן בגילוי מוקדם והן במחקרי התפתחות מאוחרים יותר, כולל יעילות טיפולית ובדיקות בטיחות 1,3,4,5. משק החי מציע יתרונות ברורים בהשוואה למודלים של מכרסמים לתרגום יעיל יותר עבור יישומים אנושיים עבור מחלות מסוימות, כולל קריפטוספורידיוזיס, סלמונלוזיס, שחפת, וירוס סינסיטיאלי נשימתי וברוצלוזיס 1,7,8. ואכן, מחלות אלה ואחרות מתפתחות באופן ספונטני בבקר, החולק מספר פתוגנזה של מחלות ותהליכים חיסוניים מקבילים לבני אדם, וכאוכלוסייה מוחצנת, הבקר מחקה את ההטרוגניות הגנטית והסביבתית המשפיעה על תגובות החיסון האנושיות 5,8,9,10 . ניתן למקסם את היתרונות של מודלים של בקר לחקר מחלות זיהומיות על ידי שימוש תחילה במערכת תרביות מתוחכמת ולאחר מכן יישום מחקרי in vivo בהדרגה. השימוש הראשוני במערכת מורכבת ביותר של תרביות בקר יכול להפחית באופן משמעותי את מספר המחקרים בבעלי חיים תוך שיפור הסיכויים למחקר תרגומי ויישומי מוצלח. מודלים של תרבית צריכים לשחזר את תהליכי המחלה ברמת האיבר לקבלת תוקף ניבוי אופטימלי, תוך שמירה על מיקרו-סביבה טבעית של הרקמה מבחינה מרחבית ותפקודית.
התגובה החיסונית הרירית היא מערכת רבת פנים המורכבת ממחסום יעיל ביותר שנוצר על ידי אנטרוציטים במערכת העיכול ואוכלוסיות מגוונות של תאי חיסון הממוקמים מתחת לפני השטח של הרירית11. מערכת מורכבת זו היא קריטית במהלך זיהום בשמירה על הומאוסטזיס במערכת העיכול והפעלת הגנה חיסונית נגד פתוגנים אנטריים11. תקשורת בין אנטרוציטים לבין תאי מערכת החיסון המולדת הבסיסית יוזמת התפתחות של תגובות חיסוניות מגינות מפני מיקרואורגניזמים פתוגניים. לפיכך, מערכות תרבית שהן השוואתיות ברמת המורכבות שלהן נחוצות לחקירה אופטימלית של אינטראקציות פתוגן מארח-אנטרי והן יעילות ביותר בהבנת הפיזיולוגיה האנטרית וגילוי ופיתוח תרופות12,13. אורגנואידים הם מערכת תרבית חזקה הדומה לארכיטקטורה ולתפקוד של רקמת המקור14,15. הרב-תאיות של מודלים אלה מאפשרת לחקור את תפקידן של אוכלוסיות תאים מגוונות ואת האינטראקציות התאיות המעורבות בבריאות אנטרית ובמחלות12,14. עם זאת, מודלים אורגנואידים שמקורם בבני אדם במחקר מוגבלים כיום על ידי הקושי להשיג כמות מספקת ואיכות עקבית של תאי אפיתל מעיים אנושיים ויכולת קיום מוגבלת של תאים בתרבית. קווי תאים אימורטליים יכולים לשמש להשגת תפוקות גבוהות של תרביות הומולוגיות במודלים אלה באופן עקבי; עם זאת, תאים מותמרים מטבעם חסרים את המגוון ואת המורכבות התפקודית של תאי אפיתל שאינם מותמרים 16,17. היתרונות של שימוש בתרביות שמקורן ברקמת בקר כמודל לחקר מחלות ופיזיולוגיה של מערכת העיכול כוללים את הקלות שבה ניתן לקבל דגימות רקמה באופן עקבי מתורמים בריאים, שיפור יכולת הקיום של התא ומגוון תאי גדול יותר שניתן להשיג רק עם רקמה שאינה בת אלמוות. שעתוק רקמות השוואתי ואפיון אורגנואידים במעי חושפים דמיון בגנים אורתולוגיים שמורים ובפוטנציאלים תאיים בין בני אדם לבקר18. לכן, מערכת תרבית שמקורה באורגנואידים של בקר עשויה להיות מועילה בחקירת מחלות מעיים אנושיות, עם ממצאים הניתנים לתרגום בקלות לרפואה אנושית. 
הפרוטוקול המתואר כאן מפרט פלטפורמה יעילה להערכת תגובות המארח לפתוגנים או תרכובות אנטריות ולפיזיולוגיה של המעי באמצעות מערכת תרבית תאים ראשונית דו-ממדית שמקורה באנטרואיד בקר. שלא כמו אורגנואידים תלת-ממדיים, מערכות תרבית דו-ממדיות הנוצרות על תוספות טרנסוול מאפשרות תרבית כפולה של תאי מעיים עם תאי חיסון או סטרומה, ומאפשרות לחקור את הדינמיקה ברמת הרקמה. עם יישומים במחקר ביו-רפואי, פיתוח תרופות ובדיקות יעילות, מודל פיזיולוגי רלוונטי זה יכול להועיל לבריאות ולקידום של בקר ובני אדם כאחד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL pipette tip&#160;</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-200RK-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m PET 24-well cell culture inserts&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL pipette tip&#160;</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-1250RK-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture vessel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipet tip</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>30075307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin -18 (C-04)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB668-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement without vitamin A&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12-587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belysa software</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>40-122</td>
			<td>Immunoassay curve fitting software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin acetate</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S3073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogranin-A (E-5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-271738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-540-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Neptune scientific</td>
			<td>3471.X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Ultimatrix RGF BME&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30271.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#3195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35070CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult organoid Differentiation medium (Human)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>100-0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult organoid growth medium (Human)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>0-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700&#160;</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2157299 (Galunisertib)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAGPIX system</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>Magpix system</td>
			<td>Compact multiplexing unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BCYT1-33K</td>
			<td>Bead-based multiplex assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriFreeze D10 Cryopreservation Media&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-713-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88880021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3Csk4</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>dot scientific inc.</td>
			<td>#HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-FITC&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5782/12U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17)</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>A009902-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (FHPI)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MaxQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7465-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S6525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue dye&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express enzyme&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Millicell ERS-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632&#160;</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a bovine primary enteroid-derived two-dimensional monolayer culture system for applications in translational biomedical research

מערכות תרבית תאים אורגנואידים יכולות לשחזר את המורכבות שנצפתה ברקמות, מה שהופך אותן לשימושיות בחקר אינטראקציות בין פונדקאי לפתוגן, הערכת יעילות ורעילות של תרופות וביו-הנדסה של רקמות. עם זאת, יישום מודלים אלה מהסיבות המתוארות עשוי להיות מוגבל בגלל האופי התלת-ממדי (3D) של מודלים אלה. לדוגמה, שימוש במערכות תרבית אנטרואידים תלת-ממדיות לחקר מחלות עיכול הוא מאתגר בשל חוסר הנגישות של לומן המעי והחומרים המופרשים שלו. ואכן, גירוי של אורגנואידים תלת-ממדיים עם פתוגנים דורש מיקרו-הזרקה לומינלית, הפרעה מכנית של המבנה התלת-ממדי, או יצירת אנטרואידים אפיקליים. יתר על כן, אורגנואידים אלה אינם ניתנים לתרבית משותפת עם תאי מערכת החיסון ותאי סטרומה, מה שמגביל ניתוח מכניסטי מעמיק לדינמיקה פתופיזיולוגית. כדי לעקוף זאת, ביצענו אופטימיזציה של מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית (2D) של תא ראשוני בקר, המאפשרת תרבית משותפת עם סוגי תאים רלוונטיים אחרים. קריפטים איליאליים שבודדו מבקר בוגר בריא תורבתו כדי ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים שנשמרו בהקפאה לשימוש עתידי. חד-שכבה דו-ממדית נוצרה באמצעות אנטרואידים תלת-ממדיים שקמו לתחייה ועברו ושיבשו כדי להניב תאים בודדים, שנזרעו על תוספות תרבית תאי טרנסוול מצופות קרום מרתף, ובכך חשפו את פני השטח האפי שלהם. הקוטביות החד-שכבתית של המעי, התמיינות התא ותפקוד המחסום אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי ומדידת התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית. גירוי של פני השטח האפיקליים של המונושכבה חשף את הפונקציונליות הצפויה של החד-שכבתי, כפי שהודגם על ידי הפרשת ציטוקינים הן מהתאים האפיקליים והן ממדורי הבסיס. המודל החד-שכבתי הדו-ממדי שמקורו באנטרואידים טומן בחובו הבטחה גדולה בחקירת אינטראקציות פונדקאי-פתוגן ופיזיולוגיה של המעי, פיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית.

Animal models in research play a crucial role in enhancing our understanding of disease pathophysiology and the dynamics of the host immune response during infection and support the development of novel preventative and therapeutic strategies1,2,3,4. These models support research discovery and advancement in animals and are key to the progress of human health research. For decades, rodent models have underpinned advances in immune mechanisms and fundamental biology research for human diseases3,5,6,7. While rodent models are critical in screening and early development research, large animal models offer a more relevant comparison in researching human diseases in both early discovery and later development studies, including therapeutic efficacy and safety testing1,3,4,5. Livestock offers clear advantages compared to rodent models for more efficient translation for human applications for some diseases, including cryptosporidiosis, salmonellosis, tuberculosis, respiratory syncytial virus, and brucellosis1,7,8. Indeed, these diseases and others develop spontaneously in cattle, which share several analogous disease pathogenesis and immune processes to humans, and as an outbred population, cattle mimic the genetic and environmental heterogeneity influencing human immune responses5,8,9,10. The benefits of bovine models for infectious disease research can be maximized by first employing a sophisticated culture system and then implementing in vivo studies stepwise. The initial use of a highly complex bovine-derived culture system can considerably reduce the number of live animal studies while improving the chances of successful translational and applied research. Culture models should recapitulate the disease processes at an organ level for optimal predictive validity, retaining the native tissue microenvironment spatially and functionally.
The mucosal immune response is a multifaceted system comprised of a highly efficient barrier formed by gastrointestinal enterocytes and diverse populations of immune cells located below the mucosal surface11. This highly complex system is critical during infection in maintaining GI homeostasis and initiating immune defenses against enteric pathogens11. Communication between enterocytes and underlying innate immune cells initiates the development of protective immune responses against pathogenic microorganisms. As such, culture systems that are comparative in their level of complexity are necessary for an optimal investigation into host-enteric pathogen interactions and are highly effective in understanding enteric physiology and drug discovery and development12,13. Organoids are a robust culture system that resembles the architecture and function of the tissue of origin14,15. The multicellularity of these models permits investigation into the role of diverse cell populations and the cellular interactions involved in enteric health and disease12,14. However, human-derived organoid models in research are currently limited by the difficulty of obtaining a sufficient quantity and consistent quality of human intestinal epithelial cells and limited cell viability in culture. Immortalized cell lines can be used to obtain high yields of homologous cultures in these models consistently; however, transformed cells inherently lack the diversity and functional complexity of non-transformed epithelial cells16,17. The advantages of using cultures derived from bovine tissue as a model for investigating gastrointestinal diseases and physiology include the ease with which tissue samples can be consistently obtained from healthy donors, improved cell viability, and greater cellular diversity achievable only with non-immortalized tissue. Comparative tissue transcriptomics and characterization of intestinal organoids reveal similarities in conserved orthologous genes and cellular potentials between humans and cattle18. Therefore, a bovine organoid-derived culture system may be advantageous in investigating human intestinal diseases, with findings easily translatable to human medicine. 
The protocol described herein details an effective platform to evaluate host responses to enteric pathogens or compounds and intestinal physiology using a bovine enteroid-derived 2D primary cell culture system. Unlike 3D organoids, 2D culture systems generated on transwell inserts permit a dual culture of intestinal cells with immune or stromal cells, allowing study into the tissue-level dynamics. With applications in biomedical research, pharmaceutical development, and efficacy testing, this physiologically relevant model can benefit the health and advancement of both cattle and people alike.

מחבר זרקור: מודל אנטרואידים מתקדם לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן 

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

Our lab focuses on examining host-pathogen interactions and the immune cell dynamics that occur following infection. By using a robust cell culture model, we hope to more closely mirror the complex interactions occurring in vivo at a tissue level. Some of the published literature describing intergeneration in cattle lacks the necessary details for the protocol to be easily reproducible, making its application by inexperienced researchers challenging.The benefit of our model is that we provide an extremely detailed protocol that can be used successfully by novice researchers. Creating Transwell monolayer enables co-culture with immune cells, revealing insights into tissue pathogen interaction while maintaining in vivo like organization. This versatile model is valuable for studying numerous cattle diseases with a complexity beyond single cell models.Our lab will employ this model to investigate the immune factors influencing susceptibility to cryptosporidium infection. It will facilitate comparison between adult cattle and calves while preserving tissue architecture in the immune cell microenvironment. The findings from this work have direct translational potential to human health.

הצעד הראשון ביצירת חד-שכבות דו-ממדיות שמקורן באנטרואידים הוא להכין את החלק של רקמת המעי שנקצר (איור 1A) לדיסוציאציה של רקמות. זה נעשה על-ידי הסרת השומן המחובר והמזנטריה מהרקמה (איור 1B), ולאחר מכן חיתוך אורכי של הרקמה כדי לחשוף את פני השטח של לומן, כך שניתן יהיה להסיר את שכבת הריר של המעי על-ידי גירוד עדין באמצעות מגלשת זכוכית. לאחר מכן חותכים את מקטע המעי שנקטף לחלקי רקמה קטנים יותר ויותר (איור 1C) כדי להגביר את קלות הדיסוציאציה. לאחר מכן מנתקים את הקריפטים מהרקמה התת-רירית הבסיסית באמצעות סדרה של שטיפות המורכבות ממאגרי קלציה (איור 1D,E) ו-PBS. קריפטים של מעי מבודדים (איור 1F) מוטמעים לאחר מכן בכיפות מטריצת קרום מרתף (איור 2A) ומתורבתים במשך כמה ימים כדי ליצור אנטרואידים תלת-ממדיים. מקטע של 10 אינץ' של אילאום בקר, ניתן לבודד כ-900,000 קריפטות ולהשתמש בהן ליצירת אנטרואידים. אחרי רק כמה שעות בתרבית, הקריפטות המצופות מתחילות להתארך ולהתפתח לאנטרוספירות (איור 2B). לאחר יומיים אפשר לראות לומן מוגדר היטב (איור 2C), עם ניצנים שזוהו כבר ביום ה-4 בתרבית (איור 2D). ביום השביעי התפתחו אנטרואידים בוגרים (איור 2E). צביעת immunofluorescence של enteroid 3D בן 7 ימים מדגים את נוכחותן של שושלות תאים שונות. מיקרוסקופ קונפוקלי של אנטרואידים מדגים לוקליזציה של כתם גרעיני DAPI, חלבון E-cadherin בצומת adherens, צביעת כרומוגרנין-A (Chr-A) המראה נוכחות של תאים אנטרואנדוקריניים, Lysozyme (LYZ) המדגים תאי Paneth, וציטוקרטין-18 (CK-18) המייצג תאי אנטרוציט באיור 3. לאחר 7-10 ימים בתרבית, יש לעבור את האנטרואידים כדי לאפשר התרחבות נוספת ולמנוע צפיפות. הזמן האופטימלי למעבר אנטרואידים נקבע להיות 7-10 ימים לאחר בידוד הקריפטה הראשוני הראשוני והוא תלוי בסופו של דבר בבריאות ובקצב הצמיחה של אנטרואידים בתרבית. צפיפות הזריעה האופטימלית להשגת המורפולוגיה והכדאיות האנטרואידים הרצויות, כפי שמתואר באיור 2E, היא 400 קריפטים לכיפה. ניתן לשמר אנטרואידים בקלות בהקפאה, ושברי האנטרואידים המופשרים מתאוששים במלואם לשימוש ניסיוני לאחר שני מעברים לאחר ההפשרה. יש לציין כי לפחות שני קטעים של תרבית הקריפטה הראשונית מומלצים לפני שימור בהקפאה.
כדי לייצר חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באנטרואידים, האנטרואידים התלת-ממדיים נקצרים, ולאורך סדרה של שלבים, עוברים טריטוציה מכנית בנוכחות תמיסת דיסוציאציה (איור 4A) לתאים בודדים. לאחר מכן ניתן לזרוע תאים בודדים אלה על תוספת טרנסוול שצופתה מראש בתמיסת מדיה של ממברנת מרתף. בממוצע, ניתן לזרוע ארבעה טרנסוולים מארבע כיפות אנטרואידים תלת-ממדיות. מספר האנטרואידים התלת-ממדיים המעובדים תלוי אפוא במספר הטרנסוולים הדרושים לניסוי. ציפוי תאים בודדים בצפיפות זריעה של 1 x 105 וטיפוחם בתחילה בנוכחות 20% FBS (איור 4B-D) יכול ליצור חד-שכבה מתמזגת תוך פחות משבוע אחד. ניתן לנטר את המפגש המתקדם של החד-שכבה הדו-ממדית בתרבית לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 4E,F). מדידות של התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) יכולות לאשר את המפגש ולאפיין את שלמות מחסום האפיתל לאורך זמן ובתגובה לגירוי ניסיוני (איור 5A). בממוצע, לאחר שבעה ימים בתרבית, לחד-שכבה מתמזגת בערך 100% יהיה ערך TEER מתאים של ~1500 Ω·cm2. הערכת אורך של ערכי TEER חד-שכבתיים אנטרואידים דו-ממדיים מראה עלייה מתמדת בערכי TEER במשך שבעה ימים, ומגיעה לערך ממוצע מרבי של 1546 Ω·cm2 לפני ירידה עם הערך הנמוך ביותר של 11.5 Ω·cm2 שהתקבל ביום השנים-עשר (איור 5B). תיוג אימונופלואורסצנטי של חד-שכבות מובחנות מצביע על כך שגיליונות אפיתל מעיים שלמים, מאורגנים ומקוטבים נוצרים באמצעות פרוטוקול זה (איור 6). מיקרוסקופ קונפוקלי של החד-שכבה הדו-ממדית המוכתמת מדגים לוקליזציה של כתמים גרעיניים DAPI, E-cadherin ו-F-actin (איור 6A-D). מיקרוסקופ פלואורסצנטי של החד-שכבה הדו-ממדית מראה סימני היכר של תאי אפיתל מעי ממוינים עם צביעת כרומוגרנין-A (Chr-A) המראה נוכחות של תאים אנטרואנדוקריניים, ליזוזים (LYZ) המדגים תאי פאנת, וציטוקרטין-18 (CK-18) המציין שושלות תאים אנטרוציטיים (איור 6E-L). מידול Z-stack מראה את הקיטוב הצפוי של תרבית חד-שכבתית דו-ממדית עם שיקוע אופייני של F-actin שנמצא במיקרוווילי המכסה את ההיבט האפי של האנטרוציטים המתמיינים ו-E-cadherin, חלבון הממוקם בצמתים הנצמדים בין תאי אפיתל (איור 6M).
ניתן להעריך את הפונקציונליות של החד-שכבה על ידי גירוי אפיקלי עם רכיבים שונים, כולל ליגנדות או פתוגנים של קולטן דמוי אגרה (TLR), ולאחר מכן כימות ציטוקינים של תרביות תאים סופרנאטנטים שנקצרו מהתאים האפיקליים והבזאליים. ואכן, כאשר האספקט האפי של המונושכבה מגורה במשך 24 שעות עם אגוניסט TLR 1/2 Pam3csk4 ביום הרביעי של התרבית, נצפה ייצור ציטוקינים מוגבר בשני התאים בהשוואה למונושכבות שלא טופלו (איור 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig1.jpg"> איור 1: בידוד קריפטת מעיים של בקר מבקר בוגר בריא. תמונות הממחישות את עיבוד הרקמה של (A) אילאום בקר בוגר שלם, (B) אילאום נטול שומן, (C) אילאום מחולק לחתיכות בגודל 2.5 אינץ' (6.3 ס"מ) ב-PBS על קרח, (D) קטעי רקמה איליאלית בחיץ דיסוציאציה #1 ב-4°C, ו-(E) בחיץ דיסוציאציה 2 באמבט מים רועדים ב-37°C, ו-(F) שברי קריפטה איליאליים מבודדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig2.jpg"> איור 2: התפתחות אנטרואידית תלת-ממדית ראשונית של בקר בממברנת מרתף. תמונות מייצגות של (A) כיפות אנטרואידיות תלת-ממדיות שנוצרו בצלחת תרבית רקמה בעלת 6 בארות והתפתחות אנטרואידית תלת-ממדית (B-E) מימים 0, 2, 4 ו-7 בתרבית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig3.jpg"> איור 3: אנטרואידים תלת-ממדיים של מעיים מראים צביעה של שושלת תאי אפיתל. תמונות מייצגות של אנטרואידים תלת-ממדיים לאחר 7 ימים בתרבית מדגימות נוכחות של כתם גרעיני, F-אקטין , ציטוקרטין-18 (CK-18), כרומוגרנין-A (Chr-A), אקאדהרין (E-cad), ליזוזים (Lyz) ושכבת על של תמונות (מיזוג). סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig4.jpg"> איור 4: התבססות של חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באנטרואידים מאנטרואידים איליאליים. תמונות מייצגות של (A) מקטעים אנטרואידים תלת-ממדיים בתמיסת דיסוציאציה כהכנה לזריעה חד-שכבתית, תאים בודדים המצופים על תוספת טרנסוול בצפיפות זריעה של 1 x 105 שצולמו ביום 0 באמצעות (B) אור, (C) ניגודיות פאזה, ו-(D) מיקרוסקופ שדה בהיר, ופיתוח חד-שכבתי על תוספות טרנסוול שצולמו ביום החמישי באמצעות (E) ניגודיות פאזה ו-(F) מיקרוסקופ שדה בהיר. הגדלה וסרגל קנה מידה פי 40 = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig5.jpg"> איור 5: מדידות התנגדות חשמלית טרנסאפיתליאלית (TEER) של חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באנטרואיד על תוספות טרנסוול. (A) דיאגרמה סכמטית של האופן שבו מדידות TEER של חד-שכבה דו-ממדית של תאי אפיתל המעי (IEC) מתקבלות באמצעות אלקטרודות STX2 של וולטומטר, (B) ניטור אורכי של מדידות TEER חד-שכבתיות דו-ממדיות במשך 12 יום בתרבית תאים. כל נקודת נתונים מייצגת ערך TEER ממוצע ושגיאת תקן של ממוצע (SEM) המתקבלים משני עותקים משוכפלים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig6.jpg"> איור 6: חד-שכבות דו-ממדיות מובחנות שמקורן באנטרואידים על תוספות טרנסוול מתפתחות ליריעות אפיתל מעי מקוטבות. (א-מ) תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות של שכבה חד-שכבתית דו-ממדית שמקורה באנטרואיד על גבי החדרת טרנסוול לאחר 5 ימים בתרבית המציגות את הגרעין (A) (כחול), (B) E-cadherin (אדום), (C) F-actin (ירוק) ו-(D) שכבת העל של 3 התמונות (מיזוג), (E,I) כתם גרעיני, (F) כרומוגרנין-A, (J) ציטוקרטין-18, (G,K) ליזוזים ו-(H,L) מיזוג תמונות. (M) מידול Z-stack המראה את ההתפלגות של אותם חלבוני סמן תאי אפיתל של גיליון חד-שכבתי דו-ממדי. התמונות התקבלו משני שכפולים ביולוגיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig7.jpg"> איור 7: חד-שכבות דו-ממדיות ראשוניות של בקר שמקורן באנטרואידים על תוספות טרנסוול פעילות מבחינה פונקציונלית. הפרשת ציטוקינים סופרנאטנטיים בתרבית תאים אפית ובזאלית של (A) IL-1α, ו-(B) IL-8 על ידי מונושכבות דו-ממדיות על תוספות טרנסוול לאחר 5 ימים בתרבית שלא טופלו או עוררו עם Pam3csk4 במשך 24 שעות. הנתונים מייצגים את רמות הציטוקינים הממוצעות ואת SEM מחד-שכבות שמקורן במלאי קפוא של קריפטות מחיה אחת ומשלושה ניסויים עצמאיים. הציטוקינים כומתו באמצעות בדיקת מולטיפלקס מבוססת חרוזים (Table of Materials) על פי הוראות היצרן ונותחו על יחידת ריבוב קומפקטית (Table of Materials) ותוכנה להתאמת עקומת אימונואסאי (Table of Materials). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: המלאי והריכוזים הסופיים של הריאגנטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced Enteroid Model for Studying Host-Pathogen Interactions at JoVE.com

אנטרואידים מתגלים כמודל חדשני לחקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של רקמות, פיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבית דו-ממדית ממקור אנטרואידים של תאים ראשוניים בקר, המאפשרת תרבית משותפת עם סוגי תאי רקמה רלוונטיים. מודל זה מציע יתרון תרגומי למודלים של מחקר במערכת העיכול.

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

המעבדה שלנו מתמקדת בבחינת אינטראקציות מארח-פתוגן והדינמיקה של תאי מערכת החיסון המתרחשות לאחר זיהום. על ידי שימוש במודל תרבית תאים חזק, אנו מקווים לשקף מקרוב יותר את האינטראקציות המורכבות המתרחשות in vivo ברמת הרקמה. חלק מהספרות שפורסמה המתארת התחדשות בין-גבית בבקר חסרה את הפרטים הדרושים כדי שהפרוטוקול יהיה ניתן לשחזור בקלות, מה שהופך את יישומו על ידי חוקרים חסרי ניסיון למאתגר.היתרון של המודל שלנו הוא שאנו מספקים פרוטוקול מפורט ביותר שיכול לשמש בהצלחה חוקרים מתחילים. יצירת Transwell monolayer מאפשרת תרבית משותפת עם תאים חיסוניים, חושפת תובנות על אינטראקציה פתוגן רקמות תוך שמירה על ארגון in vivo. מודל רב-תכליתי זה הוא בעל ערך לחקר מחלות בקר רבות עם מורכבות מעבר למודלים של תאים בודדים.המעבדה שלנו תשתמש במודל זה כדי לחקור את הגורמים החיסוניים המשפיעים על רגישות לזיהום קריפטוספורידיום. זה יקל על השוואה בין בקר בוגר לעגלים תוך שמירה על ארכיטקטורת רקמות במיקרו-סביבה של תאי החיסון. לממצאים מעבודה זו יש פוטנציאל תרגומי ישיר לבריאות האדם.

generation-bovine-primary-enteroid-derived-two-dimensional-monolayer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

995 Views.  Midwestern University. המעבדה שלנו מתמקדת בבחינת אינטראקציות מארח-פתוגן והדינמיקה של תאי מערכת החיסון המתרחשות לאחר זיהום. על ידי שימוש במודל תרבית תאים חזק, אנו מקווים לשקף מקרוב יותר את האינטראקציות המורכבות המתרחשות in vivo ברמת הרקמה. חלק מהספרות שפורסמה המתארת התחדשות בין-גבית בבקר חסרה את הפ?...

Video: מחבר זרקור: מודל אנטרואידים מתקדם לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן 

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.