우리는 Midwestern University의 Cellular and Molecular Core Facility의 사용을 인정합니다.

3D Bovine Ileal Enteroid Culture에서 2D Monolayer 확립

<ol>
	<li>Gerdts, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing.">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li><li>Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+human+disease.">Animal models for human disease.</a> Animal Biotechnology. Chapter 8, 153-171 (2020).</li><li>Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innovative+use+of+animal+models+to+advance+scientific+research.">Innovative use of animal models to advance scientific research.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).</li><li>Hamernik, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+animals+are+important+biomedical+models.">Farm animals are important biomedical models.</a> Animal Frontiers. 9 (3), (2019).</li><li>Ribitsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering:+To+do+or+not+to+do.">Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972 (2020).</li><li>Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+model+systems+and+tools+for+basic+and+translational+human+immunology.">Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology.</a> Genome Medicine. 10 (1), 73 (2018).</li><li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models:+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research.">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li><li>Roth, J. A., Tuggle, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+models+in+translational+medicine.">Livestock models in translational medicine.</a> ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).</li><li>Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+bovine+immune+response.">Ontogeny of the bovine immune response.</a> Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).</li><li>Potter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+models+for+vaccine+development+and+testing.">Large animal models for vaccine development and testing.</a> ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).</li><li>Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., &#214;hman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immune+system+of+the+gastrointestinal+tract:+maintaining+balance+between+the+good+and+the+bad.">Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).</li><li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+Study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine.">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).</li><li>Liu, Y., Chen, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D-+and+3D-based+intestinal+stem+cell+cultures+for+personalized+medicine.">2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine.</a> Cells. 7 (12), 225 (2018).</li><li>Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+-+New+models+for+host-helminth+interactions.">Organoids - New models for host-helminth interactions.</a> Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).</li><li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids:+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research.">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 43 (2021).</li><li>Hamilton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+in+vitro+enteroids+derived+from+bovine+small+intestinal+crypts.">Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts.</a> Veterinary Research. 49 (1), 54 (2018).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+three-dimensional+(3D)+expansion+of+bovine+intestinal+organoids:+An+in+vitro+model+as+a+potential+alternative+to+an+in+vivo+system.">Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system.</a> Animals (Basel). 11 (7), 2115 (2021).</li><li>T&#246;pfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+colon+organoids:+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms.">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicology in Vitro. 61, 104606 (2019).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical,+biomolecular+and+biochemical+characterization+of+bovine+epithelial+intestinal+primocultures.">Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.</a> BMC Cell Biology. 6, 42 (2005).</li><li>Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in-vitro+model+for+studying+the+interaction+of+Escherichia+coli+O157:H7+and+other+enteropathogens+with+bovine+primary+cell+cultures.">An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li><li>Barrila, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+host-pathogen+interactions+in+the+context+of+the+microenvironment:+Three-dimensional+cell+culture+comes+of+age.">Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age.</a> Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).</li><li>Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cattle+breed+and+basal+diet+on+digestibility,+rumen+bacterial+communities,+and+eating+and+rumination+activity.">Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity.</a> Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114 (2020).</li><li>Thorne, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroid+monolayers+reveal+an+autonomous+WNT+and+BMP+circuit+controlling+intestinal+epithelial+growth+and+organization.">Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization.</a> Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).</li></ol>

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 장 생리학 및 장 질환을 조사하기 위한 생리학적으로 관련된 모델을 설명합니다. 몇몇 연구 그룹은 2D 단층 16,19,20,21,22,23,24를 포함한 소 장낭 배양물의 생성을 설명했습니다. 단층 생성이 기술적으로 크게 어려운 것은 아니지만, 성공적인 배양을 지속적으로 개발하기 위해서는 몇 가지 단계를 거치는 것이 중요합니다. 따라서 출판된 문헌에 간략하게 설명된 방법을 사용한 2D 단층의 재현성은 오가노이드 분야의 초보 연구자가 수행하기 어려울 수 있습니다. 본원에 기술된 프로토콜은 이러한 프로토콜과 다른 종에 발표된 프로토콜에서 채택된 것으로, 재현성이 높은 트랜스웰 삽입물에서의 단층 생성에 대한 단계별 가이드를 제공합니다.
본 명세서에 요약된 프로토콜은 실험 설계의 특정 목표 또는 시약의 가용성에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 실제로, 이러한 프로토콜에 따라, 성공적인 배양은 다른 간행물24에 기술된 바와 같이, 더 낮은 세포 밀도(예를 들어, 2.5 x 104)에서 또는 FBS가 없는 상태에서 단층을 파종함으로써 달성될 수 있다. 그러나 이러한 매개 변수를 변경하려면 합류 단층을 설정하기 위해 증가된 배양이 필요할 수 있습니다. 따라서 면역 세포와의 공동 배양을 포함하여 연구 설계에 필수적인 다른 요인이 실험의 특정 시간 경과를 지시하는 경우 필요에 따라 파종 밀도를 변경할 수 있습니다. 3D 장류 및 2D 단층을 생성하기 위해 이 프로토콜에 사용된 것 대신 다른 기저막 제형을 대체할 수 있지만, 최적의 기저막 대 매체 비율을 결정하기 위해서는 약간의 최적화가 필요합니다.
설명된 방법론에서 트랜스웰 인서트를 적용하면 기존 플라스틱 용기 및 3D 장내형 배양에서 단층 성장에 비해 많은 이점이 있습니다. 표준 조직 배양 플레이트와 비교하여, 단층 배양에 트랜스웰을 사용하면 장 분화와 유사한 방식으로 세포 분화 및 조직을 촉진할 수 있습니다14,25. 장 상피 장벽은 독소와 미생물이 체내로 전위되는 것을 방지하는 동시에 영양소 흡수를 촉진하는 데 매우 중요합니다. 따라서 장의 장벽 무결성이 건강하게 기능하고 장 질환 또는 화합물에 대한 반응으로 어떻게 변화하는지 이해하는 것이 중요합니다. 3D 장내형 배양과 달리, 본 명세서14,25에 입증된 바와 같이, 트랜스웰 상의 단층을 결합하고 TEER을 측정할 때 장 장벽 무결성에 대한 객관적인 평가가 가능하다. 트랜스웰(transwell)에 2D 단층을 생성하면 면역 세포 또는 기질 세포와 같은 관련 세포 유형과의 이중 배양도 가능합니다. 이를 통해 장 세포와 조직 미세환경 세포 간의 매우 중요한 누화를 특성화할 수 있으며, 이는 3D 배양으로는 달성할 수 없습니다. 단층의 정점 표면의 노출은 병원균 및 화합물에 대한 실험적 노출과 발광 산물의 수집을 가능하게 할 뿐만 아니라 장내 미생물총(intestinal microbiota) 및 분자 흡수 또는 수송 생리학(transport physiology)에 대한 조사를 포함하여 장 생리학 및 질병의 다른 측면에 대한 연구도 가능하게 한다13. 정점 및 기저 장 표면에 대한 독립적인 제어는 3D 장내형 모델에 비해 뚜렷한 이점입니다.
몇 가지 시험 실험을 통해 프로토콜의 성공에 기여한 주요 단계를 확인했습니다. 전체 장 조직 샘플은 하룻밤 동안 냉장 보관하고 다음날 처리할 수 있지만, 분리된 크립트 분획물의 붕괴를 방지하기 위해 크립트 분절의 조직 해리 및 분리 단계를 즉시 수행해야 합니다. PBS 세척을 완료한 후 세척 매체에서 크립트를 원심분리하면 2.3.10단계에 설명된 대로 크립트 고장을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 엔테로이드를 패시징하거나 단층 형성을 위해 수확할 때 BME 돔에서 엔테로이드를 분리하는 것이 필수적입니다. 세척 매체는 BME를 용해하는 데 도움이 되도록 얼음처럼 차가워야 합니다. 대조적으로, 예열된 TrypLE를 사용하고 세포 현탁액을 두 번 여과하면 단층 생성에 필요한 단일 세포를 형성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 숫자 8 모양으로 플레이트를 수동으로 조작하면 단일 셀을 트랜스웰 인서트 위에 고르게 분산시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 한계는 2D 단층이 성숙한 홀스타인 스티어(>2세)에서 생성된 장내 스톡으로부터 생성되었다는 것입니다. 송아지의 성숙한 위장관은 최적의 결과를 얻기 위해 설명된 프로토콜에 대한 약간의 수정을 필요로 할 수 있습니다. 소 품종의 장 생리학에 대한 품종별 차이는 문헌26에 기술되어 있다. 이러한 차이가 장내 및 후속 단층 생성에 영향을 미칠 수 있는지는 알 수 없지만, 차이가 있으면 프로토콜에 약간의 변경만 있을 것으로 예상됩니다. 또한 2D 배양 모델에는 몇 가지 고유한 단점이 있습니다. 3D 장내형 모델과 비교했을 때, 2D 배양은 장 조직 구조 및 세포 다양성의 일부 측면이 부족할 수 있으며, 2D 배양 증식과 관련된 제한 및 문제를 야기할 수 있다13. 여전히, 연구들은 일부 단층들이 예상되는 크립트 조직(27)을 모방할 수 있다는 것을 보여주며, 이러한 한계들 중 일부는 공기-액체 계면으로 2D 배양을 확립함으로써 극복될 수도 있다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 적용이 실험적 질문에 적합한지 여부를 결정하기 위해 이 모델의 한계를 충분히 고려해야 합니다.
이 프로토콜은 소 회장에서 유래한 장내를 사용하여 소의 위장관을 모델링하여 트랜스웰 삽입물에 단층을 형성하는 최적화된 배양 시스템을 설명합니다. 전염병 연구에서 약물 발견 및 재생 의학에 이르기까지 광범위한 응용 분야를 갖춘 이 고처리량 배양 시스템은 동물과 인간의 건강에 상호 이익이 될 수 있는 예방 및 치료 전략의 전례 없는 개발로 이어질 수 있습니다.

연구에서 동물 모델은 질병 병태생리학과 감염 중 숙주 면역 반응의 역학에 대한 이해를 높이는 데 중요한 역할을 하며 새로운 예방 및 치료 전략의 개발을 지원합니다 1,2,3,4. 이러한 모델은 동물의 연구 발견 및 발전을 지원하며 인간 건강 연구 발전의 핵심입니다. 수십 년 동안 설치류 모델은 인간 질병에 대한 면역 메커니즘과 기초 생물학 연구의 발전을 뒷받침해 왔습니다 3,5,6,7. 설치류 모델은 스크리닝 및 초기 개발 연구에서 중요하지만, 대형 동물 모델은 치료 효능 및 안전성 테스트를 포함하여 초기 발견 및 후기 개발 연구 모두에서 인간 질병을 연구하는 데 더 적절한 비교를 제공합니다 1,3,4,5. 가축은 크립토스포리디움증, 살모넬라증, 결핵, 호흡기 세포융합 바이러스 및 브루셀라병을 포함한 일부 질병에 대한 인간 응용 프로그램의 보다 효율적인 번역을 위해 설치류 모델에 비해 분명한 이점을 제공합니다 1,7,8. 실제로, 이러한 질병 및 기타 질병은 인간과 유사한 질병 발병 기전 및 면역 과정을 공유하는 소에서 자연 발생하며, 근친 개체군으로서 소는 인간의 면역 반응에 영향을 미치는 유전적 및 환경적 이질성을 모방합니다 5,8,9,10 . 감염병 연구를 위한 소 모델의 이점은 먼저 정교한 배양 시스템을 사용한 다음 in vivo 연구를 단계적으로 구현함으로써 극대화할 수 있습니다. 매우 복잡한 소 유래 배양 시스템을 초기에 사용하면 살아있는 동물 연구의 수를 크게 줄이면서 성공적인 중개 및 응용 연구의 가능성을 높일 수 있습니다. 배양 모델은 최적의 예측 타당성을 위해 장기 수준에서 질병 과정을 재현해야 하며, 공간적으로나 기능적으로 네이티브 조직 미세환경을 유지해야 합니다.
점막 면역 반응은 위장 장세포와 점막 표면 아래에 위치한 다양한 면역 세포 집단에 의해 형성된 매우 효율적인 장벽으로 구성된 다면적 시스템이다(11). 이 매우 복잡한 시스템은 감염 중에 위장 항상성을 유지하고 장 병원체에 대한 면역 방어를 시작하는 데 매우 중요합니다11. 장세포와 기저 선천성 면역 세포 간의 통신은 병원성 미생물에 대한 보호 면역 반응의 발달을 시작합니다. 따라서 복잡성 수준이 비교적 높은 배양 시스템은 숙주-장 병원체 상호 작용에 대한 최적의 조사에 필요하며 장 생리학과 약물 발견 및 개발을 이해하는 데 매우 효과적입니다12,13. 오가노이드는 기원 조직의 구조와 기능을 유사한 강력한 배양 시스템입니다14,15. 이러한 모델의 다세포성은 다양한 세포 집단의 역할과 장 건강 및 질병과 관련된 세포 상호 작용에 대한 조사를 가능하게 합니다12,14. 그러나 현재 연구에서 인간 유래 오가노이드 모델은 인간 장 상피 세포의 충분한 양과 일관된 품질을 얻기 어렵고 배양 시 세포 생존력이 제한되어 있습니다. 불멸화된 세포주는 이러한 모델에서 일관되게 높은 수율의 상동 배양을 얻는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형질전환된 세포는 본질적으로 비형질전환된 상피세포의 다양성과 기능적 복잡성이 결여되어있다 16,17. 위장 질환 및 생리학을 조사하기 위한 모델로 소 조직에서 유래한 배양액을 사용하는 것의 장점에는 건강한 기증자로부터 조직 샘플을 일관되게 얻을 수 있는 용이성, 향상된 세포 생존율, 불멸화되지 않은 조직에서만 달성할 수 있는 더 큰 세포 다양성 등이 포함됩니다. 비교 조직 전사체학 및 장내 오가노이드의 특성 분석은 인간과 소 간의 보존된 상동 유전자 및 세포 전위의 유사성을 보여줍니다18. 따라서 소 오가노이드 유래 배양 시스템은 인간 장 질환을 조사하는 데 유리할 수 있으며, 그 결과는 인간 의학으로 쉽게 번역될 수 있습니다. 
본 명세서에 기술된 프로토콜은 장 병원체 또는 화합물에 대한 숙주 반응 및 소 장내 유래 2D 1차 세포 배양 시스템을 사용하여 장 생리학을 평가하기 위한 효과적인 플랫폼을 상세히 기술한다. 3D 오가노이드와 달리 트랜스웰 인서트에서 생성된 2D 배양 시스템은 면역 세포 또는 기질 세포가 있는 장 세포의 이중 배양을 허용하여 조직 수준의 역학을 연구할 수 있습니다. 생물 의학 연구, 제약 개발 및 효능 테스트에 응용되는 이 생리학적으로 관련된 모델은 소와 사람 모두의 건강과 발전에 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL pipette tip&#160;</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-200RK-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 &#181;m PET 24-well cell culture inserts&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL pipette tip&#160;</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PR-1250RK-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture vessel&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipet tip</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>30075307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30119401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cytokeratin -18 (C-04)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB668-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement without vitamin A&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12-587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Belysa software</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>40-122</td>
			<td>Immunoassay curve fitting software&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin acetate</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S3073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromogranin-A (E-5)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-271738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-540-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>Neptune scientific</td>
			<td>3471.X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Ultimatrix RGF BME&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FERR0861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30271.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-cadherin&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#3195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2482500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT35070CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slide&#160;</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult organoid Differentiation medium (Human)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>100-0214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult organoid growth medium (Human)</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>0-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keyence BZ-X700&#160;</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY2157299 (Galunisertib)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAGPIX system</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>Magpix system</td>
			<td>Compact multiplexing unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZ-X700&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BCYT1-33K</td>
			<td>Bead-based multiplex assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty container&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriFreeze D10 Cryopreservation Media&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-713-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaking platform</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88880021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pam3Csk4</td>
			<td>invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>dot scientific inc.</td>
			<td>#HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-FITC&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5782/12U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17)</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>A009902-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (FHPI)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MaxQ 7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7465-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S6525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue dye&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE express enzyme&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltohmmeter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>Millicell ERS-2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632&#160;</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of a bovine primary enteroid-derived two-dimensional monolayer culture system for applications in translational biomedical research

오가노이드 세포 배양 시스템은 조직에서 관찰되는 복잡성을 재현할 수 있으므로 숙주-병원체 상호 작용 연구, 약물 효능 및 독성 평가, 조직 생명 공학에 유용합니다. 그러나, 설명된 이유로 이러한 모델들을 적용하는 것은 이들 모델들의 3차원(3D) 특성으로 인해 제한될 수 있다. 예를 들어, 소화기 질환을 연구하기 위해 3D 장내 배양 시스템을 사용하는 것은 장 내강과 분비 물질에 접근할 수 없기 때문에 어렵습니다. 실제로 병원균이 있는 3D 오가노이드를 자극하려면 루미날 미세주입, 3D 구조의 기계적 파괴 또는 apical-out 엔테로이드 생성이 필요합니다. 또한 이러한 오가노이드는 면역 세포 및 기질 세포와 공동 배양할 수 없어 병태생리학적 역학에 대한 심층적인 기계론적 분석이 제한됩니다. 이를 피하기 위해 소 1차 세포 2차원(2D) 장내형 단층 배양 시스템을 최적화하여 다른 관련 세포 유형과의 공동 배양을 가능하게 했습니다. 건강한 성체 소에서 분리한 회장 크립트를 배양하여 향후 사용을 위해 냉동 보존된 3D 오가노이드를 생성했습니다. 2D 단층은 단일 세포를 생성하기 위해 통과 및 파괴된 되살아난 3D 장내체를 사용하여 생성되었으며, 이 세포는 기저막 추출물 코팅 트랜스웰 세포 배양 삽입물에 파종되어 정점 표면을 노출시켰습니다. 장 단층 극성, 세포 분화 및 장벽 기능은 면역형광 현미경을 사용하고 경상피 전기 저항을 측정하여 특성화했습니다. 단층의 정점 표면의 자극은 정점 구획과 기저 구획 모두에서 사이토카인 분비에 의해 입증된 바와 같이 단층의 예상 기능을 드러냈습니다. 설명된 2D 장내 유래 단층 모델은 숙주-병원체 상호 작용 및 장 생리학, 약물 개발 및 재생 의학을 조사하는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다.

Animal models in research play a crucial role in enhancing our understanding of disease pathophysiology and the dynamics of the host immune response during infection and support the development of novel preventative and therapeutic strategies1,2,3,4. These models support research discovery and advancement in animals and are key to the progress of human health research. For decades, rodent models have underpinned advances in immune mechanisms and fundamental biology research for human diseases3,5,6,7. While rodent models are critical in screening and early development research, large animal models offer a more relevant comparison in researching human diseases in both early discovery and later development studies, including therapeutic efficacy and safety testing1,3,4,5. Livestock offers clear advantages compared to rodent models for more efficient translation for human applications for some diseases, including cryptosporidiosis, salmonellosis, tuberculosis, respiratory syncytial virus, and brucellosis1,7,8. Indeed, these diseases and others develop spontaneously in cattle, which share several analogous disease pathogenesis and immune processes to humans, and as an outbred population, cattle mimic the genetic and environmental heterogeneity influencing human immune responses5,8,9,10. The benefits of bovine models for infectious disease research can be maximized by first employing a sophisticated culture system and then implementing in vivo studies stepwise. The initial use of a highly complex bovine-derived culture system can considerably reduce the number of live animal studies while improving the chances of successful translational and applied research. Culture models should recapitulate the disease processes at an organ level for optimal predictive validity, retaining the native tissue microenvironment spatially and functionally.
The mucosal immune response is a multifaceted system comprised of a highly efficient barrier formed by gastrointestinal enterocytes and diverse populations of immune cells located below the mucosal surface11. This highly complex system is critical during infection in maintaining GI homeostasis and initiating immune defenses against enteric pathogens11. Communication between enterocytes and underlying innate immune cells initiates the development of protective immune responses against pathogenic microorganisms. As such, culture systems that are comparative in their level of complexity are necessary for an optimal investigation into host-enteric pathogen interactions and are highly effective in understanding enteric physiology and drug discovery and development12,13. Organoids are a robust culture system that resembles the architecture and function of the tissue of origin14,15. The multicellularity of these models permits investigation into the role of diverse cell populations and the cellular interactions involved in enteric health and disease12,14. However, human-derived organoid models in research are currently limited by the difficulty of obtaining a sufficient quantity and consistent quality of human intestinal epithelial cells and limited cell viability in culture. Immortalized cell lines can be used to obtain high yields of homologous cultures in these models consistently; however, transformed cells inherently lack the diversity and functional complexity of non-transformed epithelial cells16,17. The advantages of using cultures derived from bovine tissue as a model for investigating gastrointestinal diseases and physiology include the ease with which tissue samples can be consistently obtained from healthy donors, improved cell viability, and greater cellular diversity achievable only with non-immortalized tissue. Comparative tissue transcriptomics and characterization of intestinal organoids reveal similarities in conserved orthologous genes and cellular potentials between humans and cattle18. Therefore, a bovine organoid-derived culture system may be advantageous in investigating human intestinal diseases, with findings easily translatable to human medicine. 
The protocol described herein details an effective platform to evaluate host responses to enteric pathogens or compounds and intestinal physiology using a bovine enteroid-derived 2D primary cell culture system. Unlike 3D organoids, 2D culture systems generated on transwell inserts permit a dual culture of intestinal cells with immune or stromal cells, allowing study into the tissue-level dynamics. With applications in biomedical research, pharmaceutical development, and efficacy testing, this physiologically relevant model can benefit the health and advancement of both cattle and people alike.

저자 스포트라이트: 숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 고급 장내 모델 

중개 생물의학 연구에 응용하기 위한 소 1차 장내염 유래 2차원 단층 배양 시스템 생성

Our lab focuses on examining host-pathogen interactions and the immune cell dynamics that occur following infection. By using a robust cell culture model, we hope to more closely mirror the complex interactions occurring in vivo at a tissue level. Some of the published literature describing intergeneration in cattle lacks the necessary details for the protocol to be easily reproducible, making its application by inexperienced researchers challenging.The benefit of our model is that we provide an extremely detailed protocol that can be used successfully by novice researchers. Creating Transwell monolayer enables co-culture with immune cells, revealing insights into tissue pathogen interaction while maintaining in vivo like organization. This versatile model is valuable for studying numerous cattle diseases with a complexity beyond single cell models.Our lab will employ this model to investigate the immune factors influencing susceptibility to cryptosporidium infection. It will facilitate comparison between adult cattle and calves while preserving tissue architecture in the immune cell microenvironment. The findings from this work have direct translational potential to human health.

2D 장내 유래 단층을 생성하는 첫 번째 단계는 조직 해리를 위해 채취한 장 조직 절편(그림 1A)을 준비하는 것입니다. 이것은 조직에서 부착된 지방과 장간막을 제거하고(그림 1B) 조직을 세로로 절단하여 내강 표면을 노출시켜 유리 슬라이드를 사용하여 장의 점액층을 부드럽게 긁어낼 수 있도록 합니다. 그런 다음 채취한 장 절편을 점진적으로 더 작은 조직 절편으로 절단하여 해리를 용이하게 합니다(그림 1C). 그런 다음 크립트는 킬레이트 완충액(그림 1D,E) 및 PBS로 구성된 일련의 세척을 사용하여 하부 점막 조직에서 해리됩니다. 그런 다음 분리된 장 크립트(그림 1F)를 기저막 매트릭스 돔(그림 2A)에 매립하고 며칠 동안 배양하여 3D 장내류를 생성합니다. 소 회장의 10인치 절편에서 약 900,000개의 크립트를 분리하여 장내 형성에 사용할 수 있습니다. 배양에서 단 몇 시간 후, 도금된 크립트는 길어지기 시작하고 장권으로 발달합니다(그림 2B). 2일 후, 잘 정의된 내강을 관찰할 수 있으며(그림 2C), 배양 4일째에 발아 구조가 관찰됩니다(그림 2D). 7일째가 되면 성숙한 장내이드가 발달합니다(그림 2E). 7일 된 3D 장내형의 면역형광 염색은 다양한 세포 계통의 존재를 보여줍니다. 장낭생물의 공초점 현미경 검사는 DAPI 핵 염색, 부착 접합부의 E-cadherin 단백질, 장내분비 세포의 존재를 보여주는 Chromogranin-A(Chr-A) 염색, Paneth 세포를 보여주는 Lysozyme(LYZ) 및 장 세포 세포를 나타내는 Cytokeratin-18(CK-18)의 국소화를 보여줍니다. 7-10일 동안 배양한 후 장내염은 더 확장되고 과밀을 방지하기 위해 통과해야 합니다. 장내염체가 통과하는 최적의 시간은 초기 1차 소낭골 분리 후 7-10일로 결정되었으며 궁극적으로 배양 내 장내골의 건강 및 성장 속도에 따라 달라집니다. 그림 2E에 표시된 바와 같이 원하는 장내 형태 및 생존력을 달성하기 위한 최적의 파종 밀도는 돔당 400개의 크립트입니다. 장류는 쉽게 동결 보존할 수 있으며, 해동된 장내 조각은 해동 후 두 번의 통과 후에 실험용으로 완전히 회복됩니다. 특히, 냉동 보존 전에 1차 토박 배양의 최소 두 구절이 권장됩니다.
2D 장내 유래 단층을 생성하기 위해 3D 장내류를 채취하고 일련의 단계를 거쳐 해리 용액(그림 4A)이 있는 상태에서 기계적으로 단일 세포로 분쇄합니다. 그런 다음 이러한 단일 세포를 기저막 매트릭스 배양 배지 용액으로 사전 코팅된 트랜스웰 삽입물에 파종할 수 있습니다. 평균적으로 4개의 3D 장내형 돔에서 4개의 트랜스웰을 파종할 수 있습니다. 따라서 처리된 3D 장내류의 수는 실험에 필요한 트랜스웰의 수에 따라 달라집니다. 1 x 105의 파종 밀도로 단일 세포를 도금하고 20% FBS(그림 4B-D)의 존재 하에서 초기에 배양하면 1주일 이내에 합류 단층을 생성할 수 있습니다. 배양에서 2D 단층의 점진적 합류는 광학 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 모니터링할 수 있습니다(그림 4E,F). 경상피 전기 저항(TEER) 측정은 시간 경과에 따른 실험 자극에 대한 반응으로 상피 장벽 무결성을 확인하고 밀도를 확인할 수 있습니다(그림 5A). 평균적으로, 배양 후 약 100 % 합류 단층은 ~ 1500 Ω·cm2의 해당 TEER 값을 갖게됩니다. 2D 장내 단층 TEER 값의 종단 평가는 TEER 값이 7일 동안 꾸준히 증가하여 최대 평균값 1546 Ω·cm2에 도달한 후 12일째에 얻은 최저 값인 11.5 Ω·cm2로 감소하는 것을 보여줍니다(그림 5B). 분화된 단층의 면역형광 표지는 이 프로토콜을 사용하여 온전하고 조직화된 분극화된 장 상피 시트가 형성됨을 나타냅니다(그림 6). 염색된 2D 단층의 공초점 현미경은 DAPI 핵 염색, E-cadherin 및 F-actin 염색의 국소화를 보여줍니다(그림 6A-D). 2D 단층의 형광 현미경 검사는 장내분비 세포의 존재를 보여주는 Chromogranin-A(Chr-A) 염색, Paneth 세포를 보여주는 Lysozyme(LYZ) 및 장세포 세포 계통을 나타내는 Cytokeratin-18(CK-18)을 통해 분화된 장 상피 세포의 특징을 보여줍니다(그림 6E-L). Z-스택 모델링은 분화된 장세포의 정점 측면을 덮는 미세융모에서 발견되는 F-액틴과 상피 세포 사이에 이격된 부착 접합부에 위치한 단백질인 E-cadherin의 특징적인 증착과 함께 2D 단층 배양의 예상 분극을 보여줍니다(그림 6M).
단층의 기능은 TLR(Toll-like receptor) 리간드 또는 병원체를 포함한 다양한 구성 요소를 사용한 정점 자극에 의해 평가될 수 있으며, 정점 및 기저 구획에서 채취한 세포 배양 상층액의 사이토카인 정량화에 의해 평가될 수 있습니다. 실제로, 배양 4일차에 TLR 1/2 작용제 Pam3csk4를 사용하여 단층의 정점 측면을 24시간 동안 자극하면 처리되지 않은 단층에 비해 두 구획에서 사이토카인 생성이 증가된 것이 관찰됩니다(그림 7A,B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig1.jpg"> 그림 1: 건강한 성체 소의 소 장낭 분리. (A) 전체 성체 소 회장, (B) 탈지 회장, (C) 얼음 위의 PBS에서 2.5인치(6.3cm) 조각으로 절단된 회장, (D) 4°C에서 해리 완충액 #1의 회장 조직 절편, (E) 37°C의 흔들리는 수조에서 해리 완충액 2, (F) 분리된 회장 토박 조각의 조직 처리를 보여주는 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig2.jpg"> 그림 2: 기저막 기질에서의 소 1차 3D 회장 장내 발달. 배양에서 0, 2, 4, 7일째의 (A) 6웰 조직 배양 플레이트에서 생성된 3D 장형 돔 및 (B-E) 3D 장내 발달의 대표 이미지. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig3.jpg"> 그림 3: 3차원 장 장내형은 상피 세포 계통 염색을 보여줍니다. 배양 7일 후 3D 장내염체의 대표 이미지는 핵 염색, F-액틴, 사이토케라틴-18(CK-18), 크로모그라닌-A(Chr-A), 에카데린(E-cad), 라이소자임(Lyz) 및 이미지 오버레이(병합)의 존재를 보여줍니다. 눈금 막대 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig4.jpg"> 그림 4: 회장 장류에서 2D 장류 유래 단층의 확립. 단층 파종을 준비하기 위한 해리 용액 내 (A) 3D 장내성 단편의 대표 이미지, (B) 빛, (C) 위상차 및 (D) 명시야 현미경을 사용하여 0일째에 이미징된 파종 밀도 1 x 105의 트랜스웰 인서트에 도금된 단일 셀, (E) 위상차 및 (F)를 사용하여 5일째에 이미징된 트랜스웰 인서트의 단층 현상) 명시야 현미경 검사. 40x 배율 및 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig5.jpg"> 그림 5: 트랜스웰 인서트에서 2D 장유래 단층의 경상피 전기 저항(TEER) 측정. (A) 전압계의 STX2 젓가락 전극을 사용하여 2D 장 상피 세포(IEC) 단층의 TEER 측정을 얻는 방법에 대한 개략도, (B) 세포 배양에서 12일 동안 2D 단층 TEER 측정의 종단 모니터링. 각 데이터 포인트는 두 번의 기술 반복실험에서 얻은 평균 TEER 값과 평균 표준 오차(SEM)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig6.jpg"> 그림 6: 트랜스웰 삽입물에서 분화된 2D 장내 유래 단층은 편광된 장 상피 시트로 발전합니다. (오전-남) 배양에서 5일 후 트랜스웰 삽입물에서 2D 장내 유래 단층의 대표적인 면역형광 이미지는 (A) 핵(파란색), (B) E-cadherin(빨간색), (C) F-액틴(녹색) 및 (D) 3개의 이미지(병합), (E,I) 핵 염색, (F) 크로모그라닌-A, (J) 사이토케라틴-18, (G,K) 라이소자임 및 (H,L) 이미지의 병합을 보여줍니다. (M) 2D 단층 시트의 동일한 상피 세포 마커 단백질의 분포를 보여주는 Z-스택 모델링. 이미지는 2개의 생물학적 복제물로부터 얻었다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65901/65901fig7.jpg"> 그림 7: 트랜스웰 인서트의 소 1차 2D 장환자 유래 단층은 기능적으로 활성화되어 있습니다. 24시간 동안 Pam3csk4로 처리하거나 자극한 배양에서 5일 후 트랜스웰 삽입물에서 2D 단층에 의한 (A) IL-1α 및 (B) IL-8의 정점 및 기저 세포 배양 상층액 사이토카인 분비. 데이터는 1마리의 동물과 3개의 독립적인 실험에서 얻은 냉동 크립트 재고에서 파생된 단층의 평균 사이토카인 수치와 SEM을 대표합니다. 사이토카인은 제조업체의 지침에 따라 bead-based multiplex assay(Table of Materials)를 사용하여 정량화하고, 소형 multiplexing unit(Table of Materials) 및 immunoassay curve fitting 소프트웨어(Table of Materials)에서 분석하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/65901fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 시약의 재고 및 최종 농도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65901/Table%201.xlsx" target="_blank">표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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엔테로이드는 조직 생리학 및 병태생리학, 약물 개발 및 재생 의학을 연구하기 위한 새로운 모델로 부상하고 있습니다. 여기서는 관련 조직 세포 유형과의 공동 배양을 허용하는 소 일차 세포 2D 장내 유래 배양 시스템에 대해 설명합니다. 이 모델은 위장 연구 모델링을 위한 중개적 이점을 제공합니다.

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

우리 연구실은 숙주-병원체 상호 작용과 감염 후 발생하는 면역 세포 역학을 조사하는 데 중점을 둡니다. 강력한 세포 배양 모델을 사용하여 조직 수준에서 생체 내에서 발생하는 복잡한 상호 작용을 보다 밀접하게 반영할 수 있기를 바랍니다. 소의 이종화를 설명하는 출판된 문헌 중 일부는 프로토콜을 쉽게 재현하는 데 필요한 세부 정보가 부족하여 경험이 부족한 연구자가 적용하기가 어렵습니다.우리 모델의 이점은 초보 연구원이 성공적으로 사용할 수 있는 매우 상세한 프로토콜을 제공한다는 것입니다. Transwell 단층을 생성하면 면역 세포와의 공동 배양이 가능하여 생체 내 유사 조직을 유지하면서 조직 병원체 상호 작용에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 다재다능한 모델은 단일 세포 모델을 넘어 복잡성을 가진 수많은 가축 질병을 연구하는 데 유용합니다.우리 연구실은 크립토스포리디움 감염에 대한 감수성에 영향을 미치는 면역 요인을 조사하기 위해 이 모델을 사용할 것입니다. 성체 소와 송아지의 비교를 용이하게 하는 동시에 면역 세포 미세환경에서 조직 구조를 보존할 수 있습니다. 이 연구의 결과는 인간의 건강에 직접적인 번역 잠재력을 가지고 있습니다.

generation-bovine-primary-enteroid-derived-two-dimensional-monolayer

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

983 조회수.  Midwestern University. 우리 연구실은 숙주-병원체 상호 작용과 감염 후 발생하는 면역 세포 역학을 조사하는 데 중점을 둡니다. 강력한 세포 배양 모델을 사용하여 조직 수준에서 생체 내에서 발생하는 복잡한 상호 작용을 보다 밀접하게 반영할 수 있기를 바랍니다. 소의 이종화를 설명하는 출판된 문헌 중 일부는 프로토콜을 쉽게 재현하는 데 필요한 세부 정보가 부족하여 경험이 부족한 연구자?...

비디오: 저자 스포트라이트: 숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 고급 장내 모델 

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.