טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה כגון, כיצד מוצר גנים שקשה לבטא ב- E.Coli מטהר. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי אין תגובה אנזימטית, מלבד PCR, הוא המוביל, ויישומים נפוצים לטיהור חלבונים ניתן להשתמש. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לטיהור חלבון במוטנים סטרפטוקוקוס, זה יכול להיות גם apprised למינים אחרים של מיקרוביוטה.

הדגמת ההליך תהיה ד"ר ממיקו ימאשיטה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. לאחר תכנון פריימר והפקת דנ"א גנומי מסטרפטוקוקוס מוטנס, בצע את ה- PCR הראשון באמצעות מוטנים סטרפטוקוקוס מסוג פראי ו- GFC שיבשו את הגנום של סטרפטוקוקוס מוטנס כתבניות PCR. הגבר את האזורים המטפחים את החלק במורד הזרם של הגן gtfC ואת אלה המטפחים את גן ההתנגדות לספקטינומיצין באמצעות gtfC-forward המוכן והתקדמות הפוכה ו- spc r-forward ו- reverse primer.

לאחר מכן, אלקטרופורזה כל מוצר PCR על 1%agarose ג'ל. השתמש ב bandcutter ג'ל כדי למלמל את שברי ה-DNA הרצויים של כ 1, 000 זוגות בסיס ו 2, 000 זוגות בסיס מן הג'ל לתוך צינורות microcentrifuge. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חיץ מנוכר לתוך כל צינור ו דגירה אותם במשך 10 דקות ב 56 מעלות צלזיוס כדי להמיס את פרוסות הג'ל.

לטהר את השברים באמצעות שיטת מיצוי ג'ל מבוססת ממברנה סיליקה. בצע PCR שני באמצעות המוצרים של PCR הראשון כתבניות PCR עם פריימרים מקוננים קדימה וקונן לאחור. כאשר מוצר PCR השני לא יכול להיות מאושר על ידי אלקטרופורזה, זוג פריימר מקונן אחר צריך להיות מתוכנן.

אלקטרופורזה חמישה מיקרוליטרים של תערובת PCR על ג'ל אגרוז. אשר את הדור של אמפייקון המתאים של כ 3, 000 זוגות בסיס על ידי אתידיום ברומיד ג'ל כתמים תמונה ולהמשיך על פי כתב היד. עכשיו, לערבב חמישה microliters של מוצר PCR השני מרוכז אל אלוציוט 50 מיקרוליטר של קר כקרח, סוג פראי מוסמך סטרפטוקוקוס מוטאן תאים, קפוא בעבר.

מוסיפים את התערובת לקובט אלקטרופולציה וממקמים את הקוט בתא הקוט של מנגנון האלקטרופוטם. תן פעימה חשמלית אחת של 1.8 קילו-וולט, 600 אוהם ו-10 מיקרופאראדות ל-2.5 אלפיות שנייה לתאים. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מרק עירוי לב-מוח לקובט.

מיד להפיץ 10 עד 100 microliters של ההשעיה על המוח-לב עירוי auger צלחות המכילות spectinomycin. הדגירה את הצלחות במשך יומיים עד שישה ימים ב 37 מעלות צלזיוס עד המושבות גדלו מספיק כדי להיות הרים. לאחר הדור של סטרפטוקוקוס מוטנס פוליהיסטידין רצף קידוד משולב זן וחיסון לילה ללא spectinomycin על פי כתב היד, צנטריפוגה ההשעיה תרבות חיידקי במשך 20 דקות ב 10, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס.

מעבירים את תרבות העל-טבעית לתוך זכוכית באורך שלושה ליטרים. כדי לרכז את החלבונים מן התרבות supernatant, מניחים את שני ליטר על טבעי על ערבוב מגנטי ולהתחיל ערבוב נמרץ. מוסיפים 1, 122 גרם של אמוניום גופרתי ומאפשרים לזרז להיווצר עם ערבוב נמרץ בארבע מעלות צלזיוס על פני תקופה של ארבע שעות או לילה. הבא.

צנטריפוגה אמוניום סולפט זירז פתרון ב 15, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. תפענח את העל-טבעי. עם מרית, לאסוף את המשקע ולהעביר אותו לתוך זכוכית 200 מיליליטר.

תן שימוש חוזר לכדורים ב-35 מיליליטר של חיץ מחייב. לאחר מכן, להעביר כל כ 25 מיליליטר של ההשעיה לתוך צינורות דיאליזה תאית מחדש. מניחים את צינורות הדיאליזה לתוך 2.5 ליטר של חיץ קשירה ערבוב על stirrer בארבע מעלות צלזיוס כדי להנייד את ההשעיה.

החלף את פתרון הדיאליזה לאחר שעתיים והמשך בדיאליזה במהלך הלילה. לאחר מכן להעביר את ההשעיה דיאליזה מן הצינורות צינורות צנטריפוגה למקם את הצינורות בצנטריפוגה ב 20, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת ציוד סינון מקטעים, יוצקים את העל-טבעי מעל מסנן קרום 0.2 מיקרומטר כדי לסנן.

מעבירים את הסינון לבקבוק 75 מיליליטר. כדי לשבר את gtfSI מתויג פוליהיסטין מן ההשעיה filtrated, תחילה להכין כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותקת. לאחר שיווי המשקל של השף על פי כתב היד, סגור את תרנגולי הצביטה של הופמן.

הוסף חמישה מיליליטר של ההשעיה המסוננת לתוך העמודה כדי להפוך תרחיף. לאחר מכן, מעבירים את כל תרחיף ההשעיה המסונן הנותרים ומערבבים את התערובת בעדינות במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. טוענים את התערובת בחזרה לעמודה.

פתח את התרנגול צביטה הופמן כדי להסיר את ההשעיה על ידי זרימת הכבידה. לשטוף את שף IMAC עם 20 מיליליטר של מאגר איגוד ולאחר מכן, elute 20 מיליליטר של מאגר אלוטיום כדי להשיג את gtfSI רקומביננטי. לאחר מכן, לטעון את eluate לתוך צינור סינון אולטרה צנטריפוגלי צנטריפוגה הפתרון ב 2, 000 פעמים g במשך 1 עד 5 דקות כדי לרכז את הפתרון.

רוקנו את מיכל הסינון והוסיפו 15 מיליליטר של מאגר אחסון לצינור. צנטריפוגה המדגם שוב לחזור על התהליך פעמיים נוספות. פתרון gtfSI רקומביננטי מרוכז סוף סוף כמיליליטר.

מעבירים את התרכיז לצינור מיקרוצנטריפוגה ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס. המשך עם פרוטוקול השחזור הפונקציונלי של השאר. בפרוטוקול זה, אלקטרופורזה ג'ל agarose מראה כי הגודל של כל אמפייקון מן PCR הראשון PCR השני התכתב עם הגודל החזוי.

מושבות סטרפטוקוקוס מוטנס השתנו עם מוצר PCR השני מצופה על המוח-לב עירוי auger צלחות המכיל ספקטינומיצין. מוצרי PCR מושבה לרוץ על ג'ל אגרוז מראה כי כל אמפייקון היה בגודל החזוי. חלבון מטוהר עם כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותק נצפתה כמו להקה אחת על ידי SDS-PAGE.

כתם מערבי, שבוצע באמצעות נוגדן אנטי פוליהיסטידין, אישר כי הלהקה שנצפו היה החלבון המתויג פוליהיסטידין הצפוי של 160 קילודלטון. יכולת יצירת הביופילם שמקורה בסוכרוז נראתה רק עם סטרפטוקוקוס מוטנס פראי מסוג וסטרפטוקוקוס מוטנס His-gtfC, שיצר ביופילם חסיד על קיר הצינור בנוכחות 1% סוכרוז. זה לא נצפה סטרפטוקוקוס מוטנס דלתא GTFC.

עם זאת, התוספת של 25 מיקרוגרם של gtfSI רקומביננטי שחזר את יכולת היווצרות ביופילם חסיד סטרפטוקוקוס mutans דלתא GTFC. מאז ההצלחה של שיטה זו תלויה הגברה PCR השני, המוצר PCR השני חייב להיות מאושר על ידי אלקטרופורזה. כבר עכשיו, חלבון מסוג היסטידין המתקבל בשיטה זו מתכנס גם לחומצות פונקציונליות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו, בשילוב עם שיבוש גנים, סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור את תפקוד הגנים.