המחברים רוצים להודות לג'רום ואלרו על עריכת כתב היד הזה. איור 1 ואיור 3I,J,L נוצרו עם BioRender.com.

כל בעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים במדריך לטיפול ושימוש בחיות ניסוי. פרוטוקול הניסוי אושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של מכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו, רשת הבריאות האוניברסיטאית.
1. ניתוח תורם
הערה: עכברי BALB/c משמשים כדוגמה לתורמים לניסוי. כל ההליכים חייבים להתבצע תוך שימוש בטכניקה סטרילית.
<ol><li>לפני ההליך, רשום את המשקל של כל עכבר.</li>
	<li>הרדימו את העכבר באמצעות תא CO2 .</li>
	<li>לאחר אישור המוות, מקם את העכבר במצב שכיבה ואבטח את הגפיים בנייר דבק.</li>
	<li>הכינו את אזור הניתוח על ידי עיקור שלו עם 70% אלכוהול איזופרופיל. הערה: במידת הצורך ובהתאם להמלצת ועדת האתיקה המקומית לבעלי חיים, יש לגזור את הפרווה מאתר החתך.</li>
	<li>בצע חתך קו אמצע על העור, החל מאמצע הבטן ומתרחב לאזור צוואר הרחם הקדמי.</li>
	<li>גישה לקנה הנשימה על ידי נסיגה זהירה של כריות השומן, הזזת שרירי הרצועה לרוחב והפרדת קנה הנשימה מרקמת החיבור שמסביב. השתמש במלקחיים כדי ליצור רווח בין קנה הנשימה לוושט.</li>
	<li>הרימו את הקסיפואיד וחתכו את הסרעפת.</li>
	<li>הרם את עצם החזה, הבטחת נתיב ברור מן החזה לאזור הצוואר על ידי החדרת hemostat. מהדקים את כלוב הצלעות משני הצדדים וחותכים דרך עצם החזה, המשתרע דרך שרירי הצוואר.</li>
	<li>הסר את בלוטת התימוס וכל שומן או שריר החוסמים את קנה הנשימה כדי לחשוף את התפצלות קנה הנשימה.</li>
	<li>חותכים את הסמפונות הראשיים ומפרידים בזהירות את דרכי הנשימה מהוושט.</li>
	<li>חותכים את הגרון ומסירים אותו.</li>
	<li>רססו את קנה הנשימה המנותח בתמיסת מלח סטרילית או בתמיסת שימור בגזה סטרילית ספוגה במי מלח סטריליים או בתמיסת שימור והניחו אותה על קרח כדי לשמר את יכולת הקיום שלה.</li>
</ol>2. ניתוח מושתל
הערה: עכברי C57BL/6 משמשים כדוגמה למושתלים עבור הניסוי.
<ol><li>יש לתת בופרנורפין בשחרור מושהה במינון של 1 מ"ג/ק"ג בבוקר יום הניתוח.</li>
	<li>יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלורן 5%.</li>
	<li>לאחר שהעכבר מורדם קלות, יש להזריק קוקטייל המורכב (0.1 מ"ג/גרם) מקסילזין וקטמין (0.01 מ"ג/גרם).</li>
	<li>החזר את העכבר לתא האינדוקציה עם 2-3% isoflurane נשמר.</li>
	<li>יש לגלח את הפרווה באתר הניתוח. כמו כן, יש לתת bupivacaine כגוש קו תת עורי לאורך אתר החניכה המתוכנן במינון של 7 מ"ג/ק"ג.</li>
	<li>אשר את היעדר תגובת רפלקס לצביטה בבוהן לפני אינטובציה orotracheal. יש לבצע אינטובציה לעכבר באמצעות צנתר תוך ורידי 20 G ולחבר אותו למכונת הנשמה בעלת נפח גאות של 500 מיקרוליטר, קצב נשימה של 120 פעימות לדקה, 100% חמצן ו-2% איזופלורן. השתמש מעמד עם מהדק מוחל על הלשון, מחזיק את החיה במצב אנכי עם הצוואר מורחב, כדי להקל על הליך זה.</li>
	<li>הפעילו כרית חימום ומקמו את העכבר במצב צדדי ימני על גבי הפד, כשהראש רחוק מהמנתח והזנב פונה למנתח (איור 2). אבטחו את הגפיים בעזרת נייר דבק. יש לשים משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.</li>
	<li>לקרצף את אזור הניתוח עם 7.5% יוד פובידון, לעקר עם 70% אלכוהול איזופרופיל, ולקרצף מחדש עם 10% יוד פובידון. יש למרוח וילונות כירורגיים סטריליים לכיסוי אזור הניתוח.</li>
	<li>העמיסו את קנה הנשימה של התורם לתוך צנתר תוך-ורידי של 16G במהלך הזמן הזה (איור 3C,D).</li>
	<li>השתמש באזמל כדי לבצע חתך בעור הנמען ולצרוב את השריר ורקמת החיבור.</li>
	<li>פתח את החלל הבין-קוסטלי החמישי או השישי והחזק את כלוב הצלעות פתוח באמצעות שני נשלפים.</li>
	<li>לנתח את הרצועה הריאתית התחתונה באמצעות צמר גפן מספריים.</li>
	<li>הדימו את יצירת המסלול עבור קנה הנשימה של התורם (איור 3G,H).</li>
	<li>אבטח את צינור זרימת ההנשמה על ידי סגירה חלקית שלו עם סטופקוק משולש כדי להקל על ניפוח הריאה השמאלית.</li>
	<li>צור מסלול על ידי ניקוב הריאה השמאלית עם מחט 20 גרם. הקפדה על כך שעומק הנקב שווה בערך לאורך האלוגרפט של קנה הנשימה. בחרו את אתר הניקוב בקצה הריאה (כפי שמצוין באיור 3I), וודאו שהמסלול עובר במקביל למשטח העליון (כפי שמסומן בעיגול כחול באיור 3J). הערה: זווית החדרה כלפי מעלה תגרום לחדירה של השכבה הפלאורלית, בעוד שזווית עמוקה יותר עלולה להוביל לדימום מכלי דם עיקריים (כפי שמסומן בצלבים אדומים באיור 3J).</li>
	<li>הכנס את הצנתר התוך-ורידי 16 G לריאה השמאלית והוציא את קנה הנשימה התורם לריאה השמאלית. לאחר החדרת אלוגרפט קנה הנשימה, שחררו את הסטופקוק התלת-כיווני כדי לאפשר זרימה פקועה ללא הפרעה דרך צינור היציאה.</li>
	<li>סגור את אתר ההזרקה הפלאורלית בעזרת קליפס (איור 3K,L). מקמו את הקליפ במדויק על אתר הניקוב, כשהקצה שלו מיושר כך שיתאים לקווי המתאר של קצה הריאה (מסומן על-ידי העיגול הכחול באיור 3L). הערה: מיקום שגוי של אתר החיתוך עלול לגרום לאיטום לא יעיל ולדליפת אוויר, בעוד שעומק קליפס לא מספיק עלול להוביל לניתוק הקליפ לאחר הניתוח (כפי שמוצג על ידי הצלבים האדומים באיור 3L).</li>
	<li>ממלאים את חלל החזה בתמיסת מלח וסופגים את המלח בגזה.</li>
	<li>מנפחים מחדש את הריאה השמאלית וסוגרים את הצלעות בטכניקת תפר ריצה.</li>
	<li>סגור את השריר והעור עם תפרים קטועים.</li>
	<li>מתן משכך כאבים meloxicam תת עורית במינון של 5 מ"ג / ק"ג בסוף הניתוח.</li>
	<li>התבונן בעכבר הנמען עד שהוא ער. לאחר מכן, הסר את צינור קנה הנשימה והכניס את העכבר המקבל לכלוב. הערה: יש לשכן עכברים מקבלים בנפרד.</li>
	<li>מתן meloxicam (5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום באמצעות הזרקה תת עורית, החל 24 שעות לאחר הניתוח ולהמשיך במשך 3 ימים לאחר הניתוח.</li>
</ol>3. איסוף דגימות מעכברים מושתלים
<ol><li>יש להשרות הרדמה בתא אינדוקציה באמצעות איזופלורן 5%.</li>
	<li>אשר את היעדר תגובת הרפלקס לצביטה בבוהן לפני אינטובציה orotracheal. שיטת האינטובציה והגדרת מכונת ההנשמה זהות לזו של ניתוח מושתל.</li>
	<li>מקם את העכבר במצב שכיבה ואבטח את הגפיים.</li>
	<li>הכינו את אזור הניתוח על ידי עיקור שלו עם 70% אלכוהול איזופרופיל.</li>
	<li>בצע חתך קו אמצע על העור, החל מאמצע הבטן ומתרחב לאזור צוואר הרחם הקדמי.</li>
	<li>להוציא את העכבר דרך הווריד קאווה התחתון באמצעות מזרק 1 מ"ל מחובר למחט 25 גרם, וכתוצאה מכך המתת חסד.</li>
	<li>פתח את החזה וגש לקנה הנשימה באותו אופן כמו עכבר תורם. קשרו את קנה הנשימה סביב צינור האינטובציה עם משי 7-0.</li>
	<li>הסירו את בלוטת התימוס, השומן והשרירים כדי לחשוף את הלב.</li>
	<li>חותכים את האטריום השמאלי, אטריום ימין, ואת הווריד הנבוב הנחות. לנקב את הריאות עם 3 מ"ל של מלוחים סטריליים דרך החדר הימני.</li>
	<li>לניתוח היסטולוגי, לנפח את הריאות עם 10% פורמלין באמצעות צינור אינטובציה.</li>
	<li>להוציא את צינור האוורור ולקשור את קנה הנשימה עם משי 7-0.</li>
	<li>לחלק את הגרון ואת הוושט. משוך אותם לכיוון נחות, ולאחר מכן לחלץ את בלוק הלב והריאות, הצבת אותו לתוך 10% פורמלין.</li>
</ol>

חקר מחלת דרכי הנשימה בהשתלות ריאה

<ol>
	<li>Chambers, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+International+Thoracic+Organ+Transplant+Registry+of+the+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation:+Thirty-fifth+adult+lung+and+heart-lung+transplant+report-2018;+Focus+theme:+Multiorgan+Transplantation.">The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-fifth adult lung and heart-lung transplant report-2018; Focus theme: Multiorgan Transplantation.</a> J Heart Lung Transplant. 37 (10), 1169-1183 (2018).</li><li>Hertz, M. I., Jessurun, J., King, M. B., Savik, S. K., Murray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+of+the+obliterative+bronchiolitis+lesion+after+heterotopic+transplantation+of+mouse+airways.">Reproduction of the obliterative bronchiolitis lesion after heterotopic transplantation of mouse airways.</a> American J Pathol. 142 (6), 1945-1951 (1993).</li><li>Ikonen, T. S., Brazelton, T. R., Berry, G. J., Shorthouse, R. S., Morris, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+re-growth+is+associated+with+inhibition+of+obliterative+airway+disease+in+orthotopic+tracheal+allografts+in+non-immunosuppressed+rats.">Epithelial re-growth is associated with inhibition of obliterative airway disease in orthotopic tracheal allografts in non-immunosuppressed rats.</a> Transplantation. 70 (6), 857 (2000).</li><li>Dutly, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+for+post-transplant+obliterative+airway+disease+reveals+angiogenesis+from+the+pulmonary+circulation.">A novel model for post-transplant obliterative airway disease reveals angiogenesis from the pulmonary circulation.</a> Am J Transplant. 5 (2), 248-254 (2005).</li><li>Wagnetz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rejection+of+tracheal+allograft+by+intrapulmonary+lymphoid+neogenesis+in+the+absence+of+secondary+lymphoid+organs.">Rejection of tracheal allograft by intrapulmonary lymphoid neogenesis in the absence of secondary lymphoid organs.</a> Transplantation. 93 (12), 1212-1220 (2012).</li><li>Hirayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+long-term+expression+of+lentivirally+delivered+IL-10+in+the+lung+attenuates+obliteration+of+intrapulmonary+allograft+airways.">Local long-term expression of lentivirally delivered IL-10 in the lung attenuates obliteration of intrapulmonary allograft airways.</a> Hum Gene Ther. 22 (11), 1453-1460 (2011).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+bone+marrow-derived+IL-17+receptor+A-positive+cells+drive+allograft+fibrosis+in+a+mouse+intrapulmonary+tracheal+transplantation+model.">Recipient bone marrow-derived IL-17 receptor A-positive cells drive allograft fibrosis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model.</a> Transpl Immunol. 69, 101467 (2021).</li><li>Matsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spleen+tyrosine+kinase+modulates+fibrous+airway+obliteration+and+associated+lymphoid+neogenesis+after+transplantation.">Spleen tyrosine kinase modulates fibrous airway obliteration and associated lymphoid neogenesis after transplantation.</a> Am J Transplant. 16 (1), 342-352 (2016).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CTLA4-Ig+on+Obliterative+bronchiolitis+in+a+mouse+intrapulmonary+tracheal+transplantation+model.">Effect of CTLA4-Ig on Obliterative bronchiolitis in a mouse intrapulmonary tracheal transplantation model.</a> Ann Thorac Cardiovasc Surg. 27 (6), 355-365 (2021).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+potent+anti-angiogenic+factor,+vasohibin-1,+ameliorates+experimental+bronchiolitis+obliterans.">A potent anti-angiogenic factor, vasohibin-1, ameliorates experimental bronchiolitis obliterans.</a> Transplant Proc. 44 (4), 1155-1157 (2012).</li><li>Aloisi, F., Pujol-Borrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+neogenesis+in+chronic+inflammatory+diseases.">Lymphoid neogenesis in chronic inflammatory diseases.</a> Nat Rev Immunol. 6 (3), 205-217 (2006).</li><li>Cupedo, T., Jansen, W., Kraal, G., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+secondary+and+tertiary+lymphoid+structures+in+the+skin.">Induction of secondary and tertiary lymphoid structures in the skin.</a> Immunity. 21 (5), 655-667 (2004).</li><li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+intrapulmonary+de+novo+lymphoid+tissue+in+obliterative+bronchiolitis+after+lung+transplantation.">The role of intrapulmonary de novo lymphoid tissue in obliterative bronchiolitis after lung transplantation.</a> J Immunol. 182 (11), 7307-7316 (2009).</li><li>Okazaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+airway+epithelium+in+acutely+rejection+orthotopic+vascularized+mouse+lung+transplants.">Maintenance of airway epithelium in acutely rejection orthotopic vascularized mouse lung transplants.</a> A J Resp Cell Mol Biol. 37 (6), 625-630 (2007).</li><li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+airway+fibrosis+in+orthotopic+mouse+lung+transplantation+models-an+experimental+reappraisal.">Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-an experimental reappraisal.</a> Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+B+cell-dependent+pathway+drives+chronic+lung+allograft+rejection+after+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">A B cell-dependent pathway drives chronic lung allograft rejection after ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Am J Transplant. 19 (12), 3377-3389 (2019).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vendor-specific+microbiome+controls+both+acute+and+chronic+murine+lung+allograft+rejection+by+altering+CD4+Foxp3++regulatory+T+cell+levels.">Vendor-specific microbiome controls both acute and chronic murine lung allograft rejection by altering CD4+Foxp3+ regulatory T cell levels.</a> Am J Transplant. 19 (10), 2705-2718 (2019).</li></ol>

למחברי כתב היד הזה אין ניגודי עניינים לחשוף.

הליך IPTT murine כולל שלבים קריטיים. לגבי הרדמה, השלב המכריע הראשון הוא אינטובציה אנדוטרכאלית. זה חיוני להחזיק את העכבר בגובה מתאים עם רגליו על השולחן כדי לדמיין את מיתרי הקול להקל על אינטובציה מיידית. בנוסף, יש צורך בנפח נשימה זהיר ובהתאמת לחץ סוף תפוגה חיובי (PEEP). בדרך כלל, נפח נשימה של 500 μL ו- PEEP...

השתלת ריאות נקבעה כטיפול יעיל לחולים עם מחלות נשימה סופניות. עם זאת, שיעור ההישרדות החציוני של מושתלי ריאות אנושיים הוא רק כ -6 שנים, עם התפתחות של ברונכיוליטיס מוחק (OB), סוג של מחלת דרכי נשימה חסימתית (OAD), להיות הגורם העיקרי למוות לאחר השנה הראשונה לאחר ההשתלה1.
מספר מודלים של בעלי חיים שימשו כדי לחקור את המנגנון העומד בבסיס OAD. מודל אחד כזה הוא מודל2 להשתלת קנה נשימה הטרוטופית (HTT). במודל זה, שתלי קנה הנשימה מושתלים ברקמה התת עורית או באומנטום של הנמען. איבוד איסכמי של תאי אפיתל שתל קנה הנשימה מתרחש, ואחריו הסננה לימפוציטים alloreactive ואפופטוזיס של תאי אפיתל תורם. פיברובלסטים ומיופיברובלסטים נודדים סביב קנה הנשימה ומייצרים מטריצה חוץ-תאית. לבסוף, מחיקה סיבית מלאה של לומן דרכי הנשימה מתרחשת. דגם HTT הוא פשוט מבחינה טכנית, מספק סביבת in vivo ומציע יכולת שחזור גבוהה.
מודל נוסף לחקר OAD הוא מודל השתלת קנה הנשימה האורתוטופית של חולדה (OTT), שבו השתלות קנה הנשימה משולבות בקנה הנשימה של המושתל כדי לשמור על אוורור פיזיולוגי3. במודל זה, דלדול תאי אפיתל מתורם כתוצאה מאיסכמיה גורם להחלפתם בתאי אפיתל מושתלים בתוך קנה הנשימה, ויוצר נתיב אוויר ללא הפרעה המלווה בפיברוזיס מתון. למרות שמודלים אלה תרמו להבנת מחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות, יש להם מגבלות במונחים של שחזור של מיקרו-סביבה פרנכימלית של הריאה.
קבוצת המחקר שלנו הציגה את מודל השתלת קנה הנשימה התוך-ריאתי של חולדה (IPTT), שבו השתלות קנה הנשימה מושתלות בריאה4 של המושתל (איור 1). מודל IPTT מציג מחיקה סיבית של לומן דרכי הנשימה המתרחשת בתוך מיקרו-סביבת הריאה. יתר על כן, הוא יושם בהצלחה על עכברים שהם מאתגרים יותר מבחינה טכנית מאשר חולדה IPTT 5,6,7,8,9,10. התאמה זו של מודל ה- IPTT של מורין אפשרה לנו להעמיק בפרטים המורכבים של הסביבה החיסונית הריאה של OAD לאחר השתלת ריאות באמצעות עכברים טרנסגניים.
מודל IPTT בעל כמה תכונות ייחודיות. האחת היא ניאואנגיוגנזה, אשר מתאפשרת על ידי מחזור הדם הריאתי וממלאת תפקיד מכריע במחיקת דרכי הנשימה 4,10. בנוסף, מודל IPTT מציג אגרגטים לימפואידים, שלחלקם יש ורידי אנדותל גבוהים המבטאים כתובת קשרית היקפית, מה שמצביע על כך שהם איברי לימפה שלישוניים (TLOs)7,8. TLOs דומים לבלוטות לימפה ומורכבים מתאי T, תאי B, ולעתים קרובות, מרכז נבט המלווה בתאים דנדריטיים פוליקולריים11,12. TLOs דווחו במחלות דלקתיות כרוניות שונות, כולל מחיקת דרכי הנשימה, מה שהופך את מודל IPTT מתאים לחקר התפקיד של TLOs בהשמדת דרכי הנשימה 7,8,11,12,13. מאמר זה מציג את המתודולוגיה של מודל ה-IPTT של מורין, במטרה להכיר לחוקרים מודל זה ולאפשר מחקרים נוספים על מחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cJ</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>8-10 weeks 25-30 g</td>
			<td>Male, Donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD 
			PrecisionGlide</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovie Change-A-Tip Deluxe High-Temperture</td>
			<td>Bovie</td>
			<td>DEL1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>8-10 weeks 25-30 g</td>
			<td>Male, Recipient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>F&#183;S&#183;T</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethicon Ligaclip Multiple -Clip Appliers-</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>LX107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps</td>
			<td>F&#183;S&#183;T</td>
			<td>11150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glover Bulldog Clamp</td>
			<td>Integra</td>
			<td>320-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito Hemostats</td>
			<td>F&#183;S&#183;T</td>
			<td>13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizon Titanium Ligating Clips</td>
			<td>Teleflex</td>
			<td>001201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M651 Manual surgical microscope for microsurgical procedures</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetix Fixator with spring lock</td>
			<td>CD+ LABS</td>
			<td>ACD-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical Scissor</td>
			<td>Jarit</td>
			<td>277-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and Perinatal Rat Ventilator Model 687</td>
			<td>Harvard</td>
			<td>55-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfadex Plus</td>
			<td>XVIVO</td>
			<td>19850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor Tip Blunt - 2.5 mm</td>
			<td>CD+ LABS</td>
			<td>ACD-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal table</td>
			<td>CD+ LABS</td>
			<td>ACD-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipro Blue 24&#34; CV-1 Taper, Double Armed</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP702X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane ointment</td>
			<td>Alconn</td>
			<td>1444062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Elastomer</td>
			<td>CD+ LABS</td>
			<td>ACD-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terumo Surflo IV Catheter, 20 G x 1 in</td>
			<td>Terumo Medical Corporation</td>
			<td>SR-OX2025CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VMT table Top</td>
			<td>benson</td>
			<td>91803300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine intrapulmonary tracheal transplantation: a model for investigating obliterative airway disease after lung transplantation

השתלת קנה נשימה תוך ריאתי (IPTT) משמשת כמודל של מחלת דרכי נשימה מוחקת (OAD) לאחר השתלת ריאות. מודל זה, שדווח לראשונה על ידי הצוות שלנו, זכה לשימוש במחקר של OAD בשל יכולת השחזור הטכנית הגבוהה שלו והתאמתו לחקר התנהגויות אימונולוגיות והתערבויות טיפוליות.
במודל IPTT, שתל קנה הנשימה של מכרסם מוכנס ישירות לריאה של המקבל דרך הצדר. מודל זה שונה ממודל השתלת קנה הנשימה ההטרוטופית (HTT), שבו השתלים מושתלים באתרים תת-עוריים או אומנטאליים, וממודל השתלת קנה הנשימה האורתוטופית (OTT) שבו קנה הנשימה התורם מחליף את קנה הנשימה של המושתל. 
יישום מוצלח של מודל IPTT דורש מיומנויות הרדמה וכירורגיה מתקדמות. מיומנויות ההרדמה כוללות אינטובציה אנדוטרכאלית של המושתל, הגדרת פרמטרים מתאימים להנשמה ואקסטובציה מתוזמנת כראוי לאחר התאוששות מהרדמה. מיומנויות כירורגיות חיוניות למיקום מדויק של השתל בתוך הריאה ולהבטחת איטום יעיל של הצדר הקרבי למניעת דליפת אוויר ודימום. באופן כללי, תהליך הלמידה אורך כחודשיים.
בניגוד למודלים HTT ו-OTT, במודל IPTT, נתיב האוויר allograft מפתח מחיקה של דרכי הנשימה במיקרו-סביבה הריאה הרלוונטית. זה מאפשר לחוקרים לחקור תהליכים אימונולוגיים ואנגיוגניים ספציפיים לריאות המעורבים במחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות. יתר על כן, מודל זה ייחודי גם בכך שהוא מציג איברי לימפה שלישוניים (TLOs), אשר נראים גם allografts ריאות האדם. TLOs מורכבים מאוכלוסיות תאי T ו- B ומאופיינים בנוכחות של ורידי אנדותל גבוהים המכוונים את גיוס תאי החיסון; לכן, הם עשויים לשחק תפקיד מכריע בקבלה ודחייה של השתל. אנו מסיקים כי מודל IPTT הוא כלי שימושי לחקר מסלולים חיסוניים ופרופברוטיים תוך ריאתיים המעורבים בהתפתחות של מחיקת דרכי הנשימה באלוגרפט השתלת ריאות.

Lung transplantation has been established as an effective treatment for patients with end-stage respiratory diseases. However, the median survival rate for human lung transplant recipients is only approximately 6 years, with the development of obliterative bronchiolitis (OB), a type of obstructive airway disease (OAD), being a major cause of death after the first year post transplantation1.
Several animal models have been utilized to investigate the mechanism underlying OAD. One such model is the heterotopic tracheal transplantation (HTT) model2. In this model, tracheal grafts are implanted into the recipient&#39;s subcutaneous tissue or omentum. Ischemia-induced loss of tracheal graft epithelial cells occurs, followed by alloreactive lymphocyte infiltration and apoptosis of donor epithelial cells. Fibroblasts and myofibroblasts migrate around the trachea, producing an extracellular matrix. Finally, complete fibrous obliteration of the airway lumen occurs. The HTT model is technically simple, provides an in vivo environment, and offers high reproducibility.
Another model for studying OAD is the rat orthotopic tracheal transplantation (OTT) model, where tracheal grafts are interposed into the recipient&#39;s trachea to maintain physiological ventilation3. In this model, ischemia-induced depletion of donor epithelial cells results in their replacement by recipient epithelial cells within the trachea, forming an unobstructed airway accompanied by moderate fibrosis. Although these models have contributed to the understanding of airway obliteration after lung transplantation, they have limitations in terms of recapitulation of the lung parenchymal microenvironment.
Our research group introduced the rat intrapulmonary tracheal transplantation (IPTT) model, where tracheal grafts are implanted into the recipient lung4 (Figure 1). The IPTT model exhibits fibrous obliteration of the airway lumen occurring within the lung microenvironment. Furthermore, it has been successfully applied to mice that are technically more challenging than rat IPTT5,6,7,8,9,10. This adaptation of the murine IPTT model enabled us to delve deeper into the intricate details of the lung immunological environment of OAD after lung transplantation using transgenic mice.
The IPTT model possesses some unique features. One is neoangiogenesis, which is facilitated by pulmonary circulation and plays a crucial role in airway obliteration4,10. Additionally, the IPTT model exhibits lymphoid aggregates, some of which have high endothelial venules expressing peripheral node addressin, indicating that they are tertiary lymphoid organs (TLOs)7,8. TLOs resemble lymph nodes and consist of T cells, B cells, and frequently, a germinal center accompanied by follicular dendritic cells11,12. TLOs have been reported in various chronic inflammatory diseases, including airway obliteration, making the IPTT model suitable for investigating the role of TLOs in airway obliteration7,8,11,12,13. This paper presents the methodology of the murine IPTT model, with the goal of familiarizing researchers with this model and facilitate further investigations into airway obliteration following lung transplantation.

מחבר זרקור: חקירת הגורמים העיקריים של ברונכיוליטיס אובליטרטיבי לאחר השתלת ריאות

השתלת קנה נשימה תוך ריאתי: מודל לחקר מחלת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות

Our research is examining chronic lung allograft dysfunction after lung transplantation. When you transplant a lung, over half the patients will develop fibrous obliteration or abnormalities of the airway. Understanding this is really the key to understanding long-term survival after lung transplantation.The importance of this model of intrapulmonary tracheal transplant is that the transplanted trachea is placed into the environment of the lung itself, and therefore you can look at an allograft versus an Isograft in terms of its response after a transplant. Most fascinating is the fact that an Isograft, even though it's had the same ischemia and the same injury, completely recovers and has normal anatomy, but an allograft develops fibrous obliteration, and understanding why that happens in an allograft is the key to understanding the underlying mechanisms of fibrosis in lung transplantation.

בהתבסס על הניסיון שלנו, מיומנות במודל זה דורשת בדרך כלל כחודשיים של הכשרה. לאחר השגת מיומנות, הליכי התורם דורשים בדרך כלל 15 דקות, בעוד שהליכי המקבל דורשים כ -30 דקות. שיעור התמותה הצפוי למפעיל מיומן הוא 0%.
באיור 4A, אלוגרפט קנה הנשימה מציג חסימה מוחלטת עם רקמה פי?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Investigating the Key Factors of Obliterative Bronchiolitis After Lung Transplantation at JoVE.com

מודל השתלת קנה הנשימה התוך-ריאתי (IPTT) הוא בעל ערך לחקר מחלת דרכי הנשימה לאחר השתלת ריאות. הוא מציע תובנות לגבי התנהגות אימונולוגית ואנגיוגנית ספציפית לריאות במחיקת דרכי הנשימה לאחר השתלה עם יכולת שחזור גבוהה. כאן, אנו מתארים את הליך IPTT ואת התוצאות הצפויות שלו.

Murine intrapulmonary tracheal transplantation (IPTT) is used as a model of obliterative airway disease (OAD) following lung transplantation. Initially ...

המחקר שלנו בוחן תפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה לאחר השתלת ריאה. כאשר אתה משתיל ריאה, מעל מחצית החולים יפתחו מחיקה סיבית או חריגות של דרכי הנשימה. הבנת זה היא באמת המפתח להבנת הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות.חשיבותו של מודל זה של השתלת קנה נשימה תוך ריאתי היא בכך שקנה הנשימה המושתל ממוקם בסביבת הריאה עצמה, ולכן ניתן להסתכל על אלוגרפט לעומת איזוגרפט מבחינת תגובתו לאחר השתלה. המרתקת ביותר היא העובדה שאיזוגרפט, למרות שעבר אותה איסכמיה ואותה פציעה, מתאושש לחלוטין ויש לו אנטומיה תקינה, אך אלוגרפט מפתח מחיקה סיבית, וההבנה מדוע זה קורה באלוגרפט היא המפתח להבנת המנגנונים הבסיסיים של פיברוזיס בהשתלת ריאות.

murine-intrapulmonary-tracheal-transplantation-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Intrapulmonary Tracheal Transplantation: A Model for Investigating Obliterative Airway Disease After Lung Transplantation

614 Views.  University Health Network. המחקר שלנו בוחן תפקוד לקוי כרוני של אלוגרפט ריאה לאחר השתלת ריאה. כאשר אתה משתיל ריאה, מעל מחצית החולים יפתחו מחיקה סיבית או חריגות של דרכי הנשימה. הבנת זה היא באמת המפתח להבנת הישרדות לטווח ארוך לאחר השתלת ריאות.חשיבותו של מודל זה של השתלת קנה נשימה תוך ריאתי היא בכך שקנ...

Video: מחבר זרקור: חקירת הגורמים העיקריים של ברונכיוליטיס אובליטרטיבי לאחר השתלת ריאות

Murine intrapulmonary tracheal transplantation (IPTT) is used as a model of obliterative airway disease (OAD) following lung transplantation. Initially reported by our team, this model has gained use in the study of OAD due to its high technical reproducibility and suitability for investigating immunological behaviors and therapeutic interventions.
In the IPTT model, a rodent tracheal graft is directly inserted into the recipient's lung through the pleura. This model is distinct from the heterotopic tracheal transplantation (HTT) model, wherein grafts are transplanted into subcutaneous or omental sites, and from the orthotopic tracheal transplantation (OTT) model in which the donor trachea replaces the recipient's trachea. 
Successful implementation of the IPTT model requires advanced anesthetic and surgical skills. Anesthetic skills include endotracheal intubation of the recipient, setting appropriate ventilatory parameters, and appropriately timed extubation after recovery from anesthesia. Surgical skills are essential for precise graft placement within the lung and for ensuring effective sealing of the visceral pleura to prevent air leakage and bleeding. In general, the learning process takes approximately 2 months.
In contrast to the HTT and OTT models, in the IPTT model, the allograft airway develops airway obliteration in the relevant lung microenvironment. This allows investigators to study lung-specific immunological and angiogenic processes involved in airway obliteration after lung transplantation. Furthermore, this model is also unique in that it exhibits tertiary lymphoid organs (TLOs), which are also seen in human lung allografts. TLOs are comprised of T and B cell populations and characterized by the presence of high endothelial venules that direct immune cell recruitment; therefore, they are likely to play a crucial role in graft acceptance and rejection. We conclude that the IPTT model is a useful tool for studying intrapulmonary immune and profibrotic pathways involved in the development of airway obliteration in the lung transplant allograft.

The murine intrapulmonary tracheal transplantation (IPTT) model is valuable for studying obliterative airway disease (OAD) after lung transplantation. It offers insights into lung-specific immunological and angiogenic behavior in airway obliteration after allotransplantation with high reproducibility. Here, we describe the IPTT procedure and its expected results.

Surgical Procedure for Intrapulmonary Tracheal Transplantation in Mice

To begin, record the weight of each mouse, then position the euthanized mouse in a supine orientation and secure its limbs with tape. Use 70%isopropyl alcohol to sterilize the surgical area. Next, create a midline incision on the skin starting from the mid-abdomen to the anterior cervical region.To access the trachea, carefully retract the fat pads, laterally move the strap muscles and separate the trachea from the surrounding connective tissue. Using forceps, create a space between the trachea and the esophagus. Then lift the xiphoid and cut the diaphragm.Insert a hemostat to raise the sternum for an unobstructed path from the sternum to the neck region. Clamp the rib cage on both sides and cut through the sternum extending through the neck muscles. Now remove the thymus and any fat or muscle obstructing the trachea to expose the tracheal bifurcation.Cut the main bronchi and carefully separate the airway from the esophagus. Afterward, cut the larynx and remove it. Spray the dissected trachea with a sterile saline solution or a preservation solution.Use sterile gauze soaked in sterile saline or preservation solution and place it on ice to maintain viability. After lightly anesthetizing the mouse and an induction chamber, intraperitoneally inject a cocktail consisting of xylazine and ketamine. Return the mouse to the induction chamber with 2 to 3%isoflurane maintained.Then shave the fur at the surgical site. Confirm the absence of reflex response to a toe pinch before orotracheal intubation. Using a 20 gauge intravenous catheter, intubate the mouse orotracheally and connect it to a ventilator with 50%oxygen and 2%isoflurane.Now, activate a heating pad and position the mouse in a right lateral position on the pad with the head away from the surgeon and the tail towards the surgeon. Then secure the limbs with tape. Apply veterinary ointment to the eyes to prevent dryness while under anesthesia.Scrub the surgical area first with 7.5 povidone iodine, then 70%isopropyl alcohol, and finally, with 10%povidone iodine. During this time, load the donor trachea into a 16 gauge intravenous catheter. After making an incision in the recipient's skin, cauterize the muscle and connective tissue.Using two retractors, open the fifth or sixth intercostal space and hold the rib cage open. Then use cotton swabs and scissors to dissect the inferior pulmonary ligament. Simulate the creation of the pathway for the donor trachea.To secure the ventilator outflow tube, partially occlude it with a three-way stopcock to facilitate inflation of the left lung. Puncture the left lung with a 20 gauge needle to create a pathway. Then insert the 16 gauge intravenous catheter into the left lung and extrude the donor trachea into it.After insertion of the tracheal allograft, release the three-way stopcock to allow unobstructed expiratory flow through the outflow tube. To close the pleural injection site, position the clip precisely onto the puncture site with its edge aligned to the contour of the lung's edge. Then fill the thoracic cavity with saline solution and absorb the saline with gauze.Reinflate the left lung and close the ribs using a running suture. Close the muscle and skin with interrupted sutures. Now, turn off isoflurane and administer meloxicam analgesic subcutaneously at the end of the surgery.Observe the recipient mouse until it is awake. Then remove the tracheal tube and put the recipient mouse in a cage. A tracheal allograft exhibited complete obstruction with fibroblastic tissue, and the epithelial cells were visibly destroyed.Conversely, a tracheal isograft remained patent, and the epithelial cells were preserved. Lymphoid aggregates were observed in the lung with the transplanted tracheal allograft.