מ.ג. מכירה בתמיכה כספית מתוכנית המסגרת H2020 של האיחוד האירופי באמצעות מועצת החדשנות האירופית (פרויקט IN-FET, GA n. 862882, פרויקט Arbor-IO, FLAG-ERA ופרויקט המוח האנושי, ID 650003) ומ- SISSA (אזור מדעי המוח). G.N. מודה בתמיכה כספית ממשרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MUR) באמצעות המענק Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (אזור מתמטיקה). אנו מודים ל- M. Gigante, B. Pastore ו- M. Grandolfo על עזרתם בהדפסה תלת-ממדית, תרבית תאים והדמיה חיה, כמו גם לד"ר P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente ו- H.C. Schultheiss על הדיונים. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.

יישומים של הדפסה בתלת-ממד עבור התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה זעיר

למחברים אין מה לחשוף.

למרות היותו בן עשרות שנים, היישום של טכנולוגיית 2PP בדפוס העתק מבוסס PDMS בקנה מידה מיקרומטרי הוא פיתוח לאחרונה43,44. בהקשר זה, סדרה של נקודות נדונות להלן כדי לסייע למשתמשים לשחזר ביעילות עבודה זו.
עבור עיצוב מודל תלת ממדי, ודא כי המודל אינו כולל חורים או הצטלבויות עצמיות. הענק הרשאה לתבנית הקובץ הבינארית בשעת שמירה כ- STL, עבור טביעת הרגל הקטנה יותר של גודל הקובץ מאשר בקידוד ASCII. זה מועיל במיוחד עבור עיצובים עם גיאומטריות מורכבות עבור אובייקטים ברוחב מיליליטר. שימוש בקבצי STL בינאריים מרמז גם על עומס CPU נמוך, בהמשך התהליך הכנת החלק המכני להדפסה תלת-ממדית. הממדים הפיזיים של התכונות בתוך קובץ STL מיוצגים ביחידות חסרות ממד. במהלך עיבוד קובץ STL, יחידות מפורשות כמיקרומטרים. לכן, מומלץ לאמץ מראש את יחידת העניין, כלומר מיקרומטר, בעת הכנת הקובץ. הדיוק של המודל המודפס נקבע על ידי מספר המשטחים הקרובים למשולשים. עבור מספר לא מספיק של משטחים, חספוס פני השטח הרצוי יתפתח. עם זאת, שאיפה לדיוק גבוה מדי על ידי מספר גדול מאוד של משטחים באה במחיר של עומס חישובי גבוה, מה שגורם לעיבוד הקובץ להיות איטי.
עבור הדפסה תלת מימדית, במהלך ההדפסה, האובייקט הפיזי התלת-ממדי נוצר באמצעות סריקת גלבו מהירה במישור x-y ותנועת piezo בכיוון z. פעולה זו ממקדת את קרן הלייזר הפמטו-שנייה בתוך כל ווקסל תלת-ממדי נתון. עם זאת, כאשר מבני ההדפסה גדולים יותר מטווחי הכיסוי המרחבי של הגאלבו והפיזו, יש לפצל את האובייקט באופן פרוגרמטי לגושים. בעוד שזו דרישה לחלקים מודפסים בגודל מילימטרי, צמתים בין בלוקים קשורים לקווי תפירה (לא מושלמים). אופטימיזציה זהירה של ספירת בלוקים ומיקום קווי תפירה בכיווני x, y ו- z חיוניים כדי למנוע הפרעה לתכונות גיאומטריות קריטיות של האובייקט הסופי עם קווי תפירה. בועות עלולות להיווצר בממשק ההדפסה מסיבות שונות (למשל, מצע הזיהומים וחוסר ההומוגניות של photoresist), ולהשפיע לרעה על איכות ושלמות המבנה המודפס. יתר על כן, כוח לייזר גבוה יותר יכול להוביל לעלייה בהתרחשותם. הפחתת עוצמת הלייזר, בשכבה הנמוכה ביותר של החלק המודפס, תמזער את הסיכויים להיווצרות בועות. כחלופה להדפסת החלק כולו כמבנה מוצק, ניתן לשקול שיטת מעטפת ופיגום. זה כרוך להדפיס רק את פני השטח החיצוניים של החלק (פגז), כמו גם אלמנטים מנסרה משולש בתוכו. אלמנטים אלה מופרדים על ידי שכבות אופקיות (פיגומים), המחזיקים את השרף הלא פולימרי בכיסים קטנים. שיטה זו מקצרת משמעותית את זמן ההדפסה, רלוונטי במיוחד עבור מבנים בגודל מילימטרי. עם זאת, מכיוון שנשאר שרף לא פולימרי, חשיפה לקרינת UV לאחר ההדפסה הכרחית כדי להבטיח יציבות מכנית מלאה, אם כי שלב זה חייב להתבצע בעדינות כדי למנוע עיוות של החלק המודפס. הזמן שלאחר הריפוי תלוי בשרף הנבחר, בעובי החלק ובעוצמת UV40. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ לבצע ניסוי ראשוני כדי להעריך את הזמן הדרוש לריפוי מעמיק מלא, באמצעות טיפת photoresist והערכת חתך חתך שלה, לאחר חשיפה UV. תקופת הריפוי הרגילה נעה בין 5 ל -20 דקות.
עבור תבניות העתק PDMS, ייצור נקי של התקן PDMS עם תכונות בקנה מידה מיקרומטרי, ללא מתקני חדר נקי, יכול להיות מאתגר: מיקרו-חלקיקים הנישאים באוויר יכולים לשכון על פני השטח הדביקים מאוד של PDMS ולעכב את האטימה בין המכשיר למצע, או לחסום את החלק של מיקרו-ערוצים בודדים. ביצוע שלבי הפרוטוקול מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית ומיגון עקבי של משטח PDMS עם איזופרופנול ממזער באופן משמעותי את סיכוני הזיהום. טמפרטורת הריפוי ומשכה משפיעים ישירות על קישור צולב PDMS ועל התכונות הפיזיקליות הנובעות מכך. בפרט, הדבקה של PDMS נרפא הוא גורם קריטי. מצד אחד, נדרש אטימה הדוקה בין מכשיר PDMS, לבין המשטח המשמש לתרבית תאים עצביים (למשל, כיסוי זכוכית או MEA), כדי להגביל ביעילות את המעבר של הנוירוטים. מצד שני, מכשיר ה-PDMS צריך להיצמד למשטח באופן הפיך, כך ששכבת הבידוד העדינה לא תיפגע לאחר הסרת המכשיר. בעוד התכווצות PDMS במהלך הריפוי מתרחשת וניתן לתקן אותה על ידי שינוי קנה מידה מראש של התבנית, עבור טמפרטורות ומרווחי ריפוי המצוינים כאן התכווצות תהיה קטנה מ -2% 42 ולא תשפיע באופן משמעותי, מכשירי PDMS חד שכבתיים. בסך הכל, עקוב במדויק אחר ערכי טמפרטורת הריפוי ומשך הזמן המומלצים, לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
סקירה כללית של יתרונות ומגבלות השיטה טכניקה המבוססת על כתיבת לייזר ישירה של 2 פוטונים מוצעת לייצור מהיר של התקנים פולימריים בקנה מידה מיקרו למחקר ניסיוני של רשתות עצביות מודולריות. בניגוד לפוטוליתוגרפיה רכה, הגישה המוצעת אינה דורשת רמה גבוהה של מומחיות טכנית, בתנאי שמערך הדפסה תלת-ממדית 2PP פונקציונלי נגיש ותפעולי. למרבה הפלא, השיטה מאפשרת מעבר ממודל תלת ממדי שתוכנן על ידי CAD למכשיר PDMS פונקציונלי תוך יום אחד, ובכך מספקת נתיב ישיר ויעיל מרעיון למימוש מוחשי. באופן ספציפי, בחירה במצב הדפסת פגז ופיגומים מפחיתה באופן משמעותי את הזמן הדרוש ליצירת התבנית, מכיוון שרק חלק קטן מהנפח שלה מודפס. ריפוי UV לאחר מכן של הרכיב המודפס מבטיח את יציבותו המכנית ואת חוסנו, כפי שאומת כאן מעל 50 מחזורי יציקה עם PDMS.
בהשוואה לשיטות מסורתיות, הדפסת תלת מימד 2PP מתגאה ביתרון ברור, הבולט ביותר כשמדובר בייצור תבניות עם יחס גובה-רוחב משמעותי, דרישות רזולוציה תובעניות וגיאומטריות תלת מימדיות מורכבות. הייצור של תבניות אב באמצעות ליתוגרפיית UV סטנדרטית מוגבל על ידי עובי התנגדות של כ 200 מיקרומטר. רצפים מורכבים של מחזורי ציפוי וחשיפה35, LIGA (ליתוגרפיה, ציפוי אלקטרוליטי ויציקה) יקרים או תהליכי תחריט יונים תגובתי עמוק (DRIE)36 נדרשים כדי להשיג יחסי גובה וגובה-רוחב גדולים יותר. בניגוד חד, כפי שהודגם בעבודה החלוצית של קומי ואחרים בשנת 201037, טכניקת 2PP מציעה טווח בלתי מוגבל למעשה ליחס הממדים של החלקים המודפסים, המשתרע מתת-מיקרומטר ועד מילימטרים. כאן הודגם תהליך מיקרו-ייצור של תבנית עם הפרש משמעותי בגובה חלקיה, הכולל הבחנה של יותר מפי 100 בין גובה המיקרו-ערוצים (5 מיקרומטר לגובה המרבי של העובש (545 מיקרומטר; ראה איור 2).
כמו כן, ניתן להשיג בקלות רזולוציה תת-מיקרומטרית על ידי ביצוע מפרטי הפרוטוקול המתוארים. לשם השוואה, השגת רזולוציות עובש משופרות באמצעות פוטוליתוגרפיה UV דורשת השקעת הון. המסכות בעלות הרזולוציה הטובה ביותר, המשתמשות בתצהיר כרום על קוורץ ברזולוציה נומינלית של 600 ננומטר, מתומחרות בכמה סדרי גודל גבוה יותר ממסכות השקיפות העילית המודפסות בלייזר, בעלות רזולוציה של 250 מיקרומטר35, אולם ראו את עבודתם של Pirlo et al.41. כדי להיות בת קיימא לשימוש פנימי, השיטה שנבחרה חייבת להיות חסכונית. עבור מעבדות ביולוגיות רבות, ההוצאה הכוללת הקשורה לפוטוליתוגרפיה רכה קונבנציונלית או כתיבה ישירה בלייזר מהווה מכשול. אמנם ניתן להפוך את שתי הטכנולוגיות לנגישות יותר על ידי רכישה והרכבה של הרכיבים החיוניים, אך גישה זו דורשת מומחיות נוספת ועדיין דורשת השקעה ניכרת. בהקשר זה, נקודה חיונית שיש לקחת בחשבון היא הספקטרום הרחב יותר של יישומים הניתנים להשגה באמצעות כתיבה ישירה בלייזר. שלא כמו פוטוליתוגרפיה רכה קונבנציונלית, המוגבלת בעיקר לייצור מיקרו-עובש, הדפסת תלת-ממד 2PP מפגינה רב-תכליתיות יוצאת דופן. היישומים הפוטנציאליים שלה משתרעים ממיקרופלואידיקה ומיקרו-אופטיקה ועד פוטוניקה ומיקרומכניקה משולבות. זה הופך את ההשקעה בטכנולוגיה זו למושכת כמתקן משותף לתחומים מדעיים מרובים ומגוונים. לדוגמה, המתודולוגיה מבוססת 2PP שפותחה בפרוטוקול זה היא תוצאה של שיתוף פעולה בין-תחומי בין מחלקות מדעי המוח והמתמטיקה בתוך המוסד שלנו. בנוסף, פיתוח photoresist הוא תחום מחקר פעיל, והוא עשוי להרחיב את מגוון היישומים של הדפסה תלת-ממדית 2PP. מקרה לדוגמה הוא ההקדמה האחרונה של שרף IP-PDMS. על ידי פילמור למבנים בעלי תכונות כמו PDMS38, שרף זה פותח את הפוטנציאל למיקרו-ייצור ישיר של רכיבים בעלי תאימות ביולוגית בעלי משטח מפותל או מכילים חללים חלולים. מורכבויות אלה עומדות כמחסומים להשגת תוצאות דומות באמצעות הליכי דפוס העתק קונבנציונליים.
כהדגמה של שיטה זו, הובאו ראיות המצביעות על התפתחות קישוריות חד-כיוונית בין שני מודולים ברשת עצבית מודולרית. התבנית בקנה מידה מיקרו, המיוצרת בטכניקת 2PP, הייתה בעלת סיבולת מספקת כדי לעבור יציקות PDMS מרובות, ויש לה את הדיוק הנדרש בקנה מידה מיקרו. לסיכום, היקף היישום של הפרוטוקול המתואר בעבודה זו משתרע מעבר למקרה המתואר. ככל שהגישה לטכנולוגיית ההדפסה 2PP הופכת נפוצה יותר ויותר, ההשקעה הראשונית הנדרשת ליישומה תקטן בעוד מגוון היישומים הפוטנציאליים שלה יתרחב.

חקירת הפעילות העצבית באורגניזמים מתנהגים מציבה מספר אתגרים. לדוגמה, הגישה הפיזית לרקמת המוח מוגבלת על ידי הצורך לשמור על שלמותה, ולכן האזורים השטחיים של המוח נחשבים בקלות רבה יותר. בידוד מטרות ספציפיות בתוך הרקמה השלמה הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה ולפעמים בלתי אפשרית. למרות שתרביות נוירונים הומוגניות מנותקות מציעות גישה נוחה לתכונות המולקולריות, הביוכימיות והביופיזיקליות של רכיבים בודדים (תת-תאיים) של מעגל עצבי, קישוריות מציאותית וארגון אנטומי של המוח השלם הולכים לאיבוד. אילוצים בסיסיים אלה היוו השראה למאמצי המחקר להשיג דרך ביניים, שבה נמנעת מורכבות in vivo בעוד שניתן לבנות את המבנה במבחנה, שהוא לפי דרישה 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בפרט, תרבויות נוירונים מודולריות היו נושא למחקר מקיף בעשורים האחרונים, במטרה להתמודד עם שאלות מפתח של פיזיולוגיה של המוח כמתואר להלן.
ארגון: מחקרי In vivo מראים כי המוח בנוי אנטומית בשכבות עם סוגי תאים מדויקים ומערכי הקרנות. בדיקות פונקציונליות חשפו את ארגון הרשתות העצביות במכלולי צמתים ומודולים, עם סכימות קישוריות מדויקות10,11. עם זאת, תפקידם של מוטיבים של קישוריות ומיקרו-מעגלים אינו יכול להיחקר כראוי in vivo בשל המספר העצום של סינפסות המעורבות, כמו גם ההשפעות השזורות של התפתחות ופלסטיות תלוית פעילות.
העברת אותות: בתרבויות in vivo או אקראיות במבחנה , זה מאתגר להעריך העברת אותות. בחינת ההולכה האקסונלית ופוטנציאל הפעולה לאורכה מחייבת הנחיית צמיחת נוירוט על ידי תפקוד פני השטח או דפוסים כימיים, מתן יחס אות לרעש גבוה בקריאות חוץ-תאיות של פעילות חשמלית12.
רלוונטיות תרגומית: פענוח התפקיד הבלעדי של אלמנטים קדם-סינפטיים לעומת פוסט-סינפטיים על פני תנאים פתולוגיים דורש גישה לאלמנטים אלה בנפרד. תרבויות מודולריות עם קישוריות מוגבלת, המפרידה ביעילות את האלמנטים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, הן כלים חיוניים למטרה זו13.
קיימות מספר שיטות להשגת צורה כלשהי של מבנה בתרבות העצבית. ניתן לסווג אותם באופן רחב כמניפולציה כימית ופיזיקלית על פני השטח9. השיטות הראשונות 14,15 מסתמכות על הנטייה של תאים עצביים להיצמד לתרכובות (ביו)כימיות מסוימות. זה דורש הפקדת מולקולות דביקות או מושכות על משטח בדיוק בקנה מידה מיקרו ומעקב אחר תבנית מפורטת. בעוד שזה מאפשר כיסוי חלקי של פני השטח של התאים, בעקבות הדפוס הרצוי, שיטות כימיות מוגבלות מטבען ויש להן שיעור הצלחה נמוך יחסית בהנחיית גדילה של נוירוטים16. שליטה מלאה בכיווניות האקסון מחייבת יצירת שיפוע מרחבי של כימיקלים אד-הוק כדי לעצב הנחיה אקסונלית17. השיטות האחרונות כרוכות במניפולציה פיזית על פני השטח ומשמשות בדרך כלל לבניית הרשתות העצביות במבחנה. תאי עצב מוגבלים פיזית במקומות הרצויים על ידי כליאה גיאומטרית, כגון תאים מיקרוסקופיים, קירות, תעלות וכו ', המעצבים פולימר תואם ביולוגית כגון polydimethylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 נרפא והתמצק למכשיר מיקרופלואידי. השיטה דה פקטו לייצור מיקרופלואידים PDMS היא פוטוליתוגרפיה רכה21, שבה מסכה דו-ממדית מעוצבת בקנה מידה מיקרו ומשמשת לחריטה סלקטיבית של חומר מבוסס סיליקון בחשיפה לקרינת UV. על קצה המזלג, שרף הניתן לריפוי UV (כלומר, photoresist) מצופה על פרוסת סיליקון באמצעות ציפוי סיבוב, ומגיע לגובה מסוים שנקבע על ידי צמיגותו ומהירות הסיבוב שלו. לאחר מכן, המסכה עם הדוגמה ממוקמת מעל התנגדות האור ונחשפת לאור UV. אזורים שקופים בתוך המסכה, המתאימים לאזורי עניין, יאפשרו לאור UV לגרום להצלבה מקומית של מולקולות הפוטו-התנגדות. האזורים של photoresist לא חשוף נשטפים באמצעות ממס, וכתוצאה מכך היווצרות של תבנית אב. זה משמש שוב ושוב כדי לאפות אלסטומר של הבחירה (כלומר, PDMS), אשר לאחר מכן חרוט עם הגיאומטריות הרצויות בכמה עותקים רצויים. שיטת ייצור כזו היא השיטה הנפוצה ביותר לייצר התקנים מיקרופלואידים22. אולי המגבלות העיקריות של פוטוליתוגרפיה רכה הן תנאי מוקדם להשקעות הון בולטות וחוסר ההיכרות של מעבדות ביולוגיות עם הטכניקות והמומחיות הנדרשות. הכנת המסכה ושלבי הפוטוליתוגרפיה הרכה הנדרשים לתכנון גיאומטריות מורכבות של יחס גובה-רוחב גבוה מרובה גבהים אינן טריוויאליות23 ולעתים קרובות דורשות מיקור חוץ. למרות שהוצעו שיטות חלופיות ודלות תקציב, הן לא תמיד עונות על דרישות הדיוק הגבוהות של אב טיפוס ביולוגי24.
כאן מוצגת שיטת ייצור חלופית, המסתמכת על פילמור שני פוטונים (2PP) וייצור תוספים. זה פשוט ואינו דורש כשלעצמו מומחיות מתקדמת במיקרו-פבריקציה ומיקרופוטוליטוגרפיה. תחום המחקר של מיקרו-ייצור 2PP הופיע בסוף שנות ה-9025, ומאז הוא עד לצמיחה אקספוננציאלית26. עוד על עקרונות היסוד של טכניקה זו ניתן למצוא במקום אחר26. בקצרה, על ידי מיקוד דחף האור העירור במרחב תלת ממדי, 2PP ממנף את התלות הלא ליניארית של בליעת מולטיפוטונים בעוצמה. זה מעניק את היכולת של ספיגה מוגבלת, ומבטיח עירור מדויק וסלקטיבי בתוך אזורים מקומיים מאוד. בעיקרו של דבר, התנגדות אור בגוון שלילי, חומר עם מסיסות מופחתת בחשיפה לאור, נתון לקרן ממוקדת של פעימות לייזר פמטו-שניות במחזור עבודה נמוך27. זה מאפשר דחפים בעוצמות גבוהות בעוצמות ממוצעות נמוכות, מה שמאפשר פילמור מבלי לפגוע בחומר. האינטראקציה של מונומרים רדיקליים המושרים על ידי אור מולידה אוליגומרים רדיקליים, המתחילים פילמור המשתרע לאורך כל הפוטו-התנגדות עד לנפח מובחן, כלומר ווקסל, שגודלו תלוי בעוצמת ומשך פעימות הלייזר28.
בעבודה זו מוצגים שני מרכיבים: A) תכנון וייצור מהיר של תבנית מודפסת בתלת-ממד, הניתנת לשימוש חוזר פעמים רבות כדי לייצר התקנים חד-פעמיים של תרביות תאים עצביים פולימריים (איור 1), ו-B) הצימוד המכני שלהם על פני השטח של מצעי תרבית תאים עצביים מישוריים, או אפילו של מערכי מיקרואלקטרודות משולבי מצע המסוגלים להקליט אותות ביואלקטריים מרובי אתרים.
תכנון בעזרת מחשב של מודל מכני תלת ממדי מתואר כאן בקצרה רבה ומלווה בשלבים המובילים לתבנית מודפסת בתלת-ממד וייצור מכשירי PDMS מפורט גם הוא.
ניתן להשתמש במגוון יישומי תוכנת תכנון בעזרת מחשב כדי ליצור את מודל האובייקטים התלת-ממדי ההתחלתי ולייצר קובץ STL כדי לשלוט בתהליך ההדפסה הדו-PP. בתוך טבלת החומרים, היישומים הראשונים והאחרונים המפורטים הם ללא תשלום או מסופקים עם רישיון חינם. בניית מודל תלת-ממדי דורשת תמיד יצירת סקיצה דו-ממדית, אשר לאחר מכן מושחלת בשלבי המידול הבאים. כדי להדגים רעיון זה, תהליך תכנון תוכנת CAD תלת מימדי גנרי מודגש בסעיף הפרוטוקול, המוביל למבנה העשוי מקוביות חופפות. לקבלת מידע מקיף יותר, מספר הדרכות מקוונות ומשאבי הדרכה ללא תשלום זמינים, כפי שמצוין בטבלת החומרים.
קובץ STL שנוצר מתורגם לאחר מכן לסדרה של פקודות שיבוצעו על-ידי מדפסת התלת-ממד (כלומר, הליך חיתוך). עבור מדפסת תלת-ממד 2PP ספציפית בשימוש, התוכנה DeScribe משמשת לייבוא קובץ STL ולהמרתו לפורמט הקנייני General Writing Language (GWL). הצלחת תהליך הדפסת 2PP תלויה בפרמטרים שונים, ובראשם עוצמת הלייזר ומהירות הסריקה, תפירה ומרחקי בקיעה-חיתוך. הבחירה של פרמטרים אלה, יחד עם הבחירה של אובייקטיבי photoresist, תלוי בתכונות הקטנות ביותר של העיצוב, כמו גם את היישום המיועד. לפיכך, אופטימיזציה של פרמטרים הופכת חיונית כדי לעמוד בדרישות של תרחישי עיצוב שונים ומקרי שימוש. עבור עבודה זו, המתכון המומלץ IP-S 25x ITO מעטפת (3D MF) נחשב כתצורה עבור פרמטרי ההדפסה. בסופו של דבר, חלק מודפס יציב מכנית מודפס ברזולוציה הדרושה תוך מזעור זמן ההדפסה התלת-ממדית שלו.
עיצוב התבנית וקובץ STL הקשור אליו, שהודגם בעבודה זו, מורכב ממסגרת ריבועית להפרדת החלל של תרבית תאים בשני תאים: אזור חיצוני (כלומר, ייקרא מקור לאחר מכן) ואזור פנימי (כלומר, ייקרא טארגט לאחר מכן). שני תאים אלה מחוברים באמצעות קבוצות של מיקרו-ערוצים, שכל אחד מהם מאופיין בגבולות חדים, שנועדו לעכב באופן ספציפי את צמיחת הנוירונים מהמטרה למקור, אך לא להיפך, וככאלה לקדם קישוריות סינפטית כיוונית בין תאי עצב הגדלים בשני האזורים.
מחקרים קודמים השתמשו בגיאומטריות שונות של מיקרו-ערוצים כדי לעודד צמיחה כיוונית של נוירוטים. דוגמאות לכך כוללות צורות משולשות18, מבני גדרות ערוץ19 ותעלות מחודדות20. כאן נעשה שימוש בעיצוב הכולל מחסומי זווית חדים מעבר לגבולות המיקרו-ערוץ, המאופיינים גם בכניסות א-סימטריות. מיקרו-ערוצים אלה משמשים ליצירת המשכיות בין תא סגור, תא המטרה, לבין האזור החיצוני, תא המקור. צורת המשפך של החלק הראשוני של המיקרו-ערוצים, מצד המקור, נועדה לקדם את היווצרותם של צרורות אקסונליים ואת צמיחתם לאורך הנתיב הקצר ביותר, כלומר קו ישר, המחבר בין המקור למטרה. למרחב המשולש הממומש על ידי עמידה מול זוויות חדות יש נפח גדול יותר בצד המטרה כדי לכוון לעיכוב יעיל של נתיבי העצבים תוך העדפת הירי המהיר של צרורות שמקורם במקור ובכיבוש של השטח הפנוי. הבחירה של 540 מיקרומטר לאורך המיקרו-ערוצים מסננת ביעילות את הצמיחה הדנדריטית הקצרה יותרבדרך כלל 39. בנוסף, גובהם 5 מיקרומטר מונע מסומטה התא לחדור דרך המיקרו-ערוצים. בסך הכל, תצורה זו הוכיחה את עצמה כמקדמת קישוריות חד-כיוונית בין מודולי היעד החיצוניים, המקוריים והפנימיים, והיא מוצגת כאן כהוכחה עקרונית בין האפשרויות החלופיות הרבות.
בעוד שהתקני PDMS, המיוצרים על ידי תבנית 2PP, יכולים להיות מחוברים לפני השטח של מצעי תרבית תאים נפוצים, כגון כיסויי זכוכית או צלחות פטרי, בעבודה זו נעשה שימוש במערכי מיקרואלקטרודות משולבים במצע מסחרי. לא נעשה כל מאמץ לייעל את התכנון התלת-ממדי למערך המיקרואלקטרודות, והצימוד המכני בוצע תחת הנחיית סטריאומיקרוסקופיה שמטרתה הייתה רק למקם את המכשיר על פני המערך, תוך השארת חלק מהמיקרואלקטרודות חשופות בשני הצדדים, המקור והמטרה. זה מאפשר הערכה ראשונית של ההשלכות התפקודיות של הקישוריות המוגבלת בתרביות תאים עצביים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB cure compact polymerizer</td>
			<td>PCube Srl</td>
			<td></td>
			<td>Wavelengths 365-405 nm, Power 120W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMed Amber Resin 1 L</td>
			<td>formlabs</td>
			<td></td>
			<td>Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD application software SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SolidWorks Corporation, US</td>
			<td></td>
			<td>Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Syst&#232;mes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). 
			&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; -------------------------------------- 
			Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html 
			Trainings: https://www.autodesk.com/training</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-AP5</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>#0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeScribe</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>106585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8242; Balanced Salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitro MEA recording system MEA2000 mini</td>
			<td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP-S Photoresist</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA recording application software (Experimenter)</td>
			<td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51412C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoWrite</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ophthalmic stab Knife 15&#176;</td>
			<td>HESTIA Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td>SN617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repel-silane ES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17133201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL</td>
			<td>Nanoscribe GmbH &#38; Co.&#160;KG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr)</td>
			<td>Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 &#181;m,Electrode diameter 30 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles&#160;</td>
			<td>CIMAMOTORI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon polymerization 3d-printing of micro-scale neuronal cell culture devices

תרביות נוירונים היו מודל ניסיוני ייחוס במשך כמה עשורים. עם זאת, סידור תאים תלת-ממדי, אילוצים מרחביים על צמיחת נוירוטים וקישוריות סינפטית מציאותית חסרים. זה האחרון מגביל את המחקר של מבנה ותפקוד בהקשר של מידור ומקטין את המשמעות של תרבויות במדעי המוח. קירוב ex vivo הסידור האנטומי המובנה של קישוריות סינפטית אינו טריוויאלי, למרות היותו המפתח להופעת מקצבים, פלסטיות סינפטית, ובסופו של דבר, פתופיזיולוגיה של המוח. כאן, פילמור שני פוטונים (2PP) משמש כטכניקת הדפסה תלת-ממדית, המאפשרת ייצור מהיר של התקני תרבית תאים פולימריים באמצעות פולידימתיל-סילוקסאן (PDMS) בקנה מידה מיקרומטרי. בהשוואה לטכניקות העתק קונבנציונליות המבוססות על מיקרופוטוליטוגרפיה, הדפסה בקנה מידה זעיר 2PP מאפשרת תפנית מהירה ומשתלמת של אבות טיפוס. פרוטוקול זה מדגים את התכנון והייצור של התקנים מיקרופלואידים מבוססי PDMS שמטרתם לטפח רשתות נוירונים מודולריות. כהוכחה עקרונית, התקן דו-תאי מוצג כדי להגביל פיזית את הקישוריות. באופן ספציפי, צמיחה אקסונלית אסימטרית במהלך התפתחות ex vivo מועדפת ומותרת להיות מכוונת מחדר אחד למשנהו. על מנת לחקור את ההשלכות התפקודיות של אינטראקציות סינפטיות חד-כיווניות, נבחרים מערכי מיקרואלקטרודות מסחריים לניטור הפעילות הביו-חשמלית של מודולים עצביים מחוברים. כאן, שיטות 1) לייצר תבניות עם דיוק מיקרומטר 2) לבצע הקלטות חוץ תאיות במבחנה multisite בתרבויות נוירונים קליפת המוח חולדה מודגמים. על ידי הפחתת עלויות ונגישות נרחבת עתידית של הדפסה תלת-ממדית 2PP, שיטה זו תהפוך לרלוונטית יותר ויותר במעבדות מחקר ברחבי העולם. במיוחד בתחום הנוירוטכנולוגיה ורישום נתונים עצביים בעלי תפוקה גבוהה, הקלות והמהירות של אבות-טיפוס המפושטים במודלים חוץ-גופיים ישפרו את הבקרה הניסויית ואת ההבנה התיאורטית של מערכות עצביות בקנה מידה גדול in vivo .

Investigating neuronal activity in behaving organisms presents several challenges. For instance, physical access to the brain tissue is limited by the need to maintain its integrity, so the brain&#39;s superficial regions are more easily considered. Isolating specific targets within the intact tissue is often a daunting task and sometimes impossible. Although dissociated homogeneous neuronal cultures offer convenient access to the molecular, biochemical, and biophysical properties of individual (sub)cellular components of a neural circuit, a realistic connectivity and anatomical organization of the intact brain is lost. These fundamental constraints inspired research efforts to achieve a middle ground, where in vivo complexity is avoided while the structure can be constructed in vitro, which is on demand1,2,3,4,5,6,7,8,9. In particular, modular neuronal cultures have been a subject of extensive research over the past decades, aiming to tackle key questions of brain physiology as described below.
Organization:&#160;In vivo studies show that the brain is structured anatomically in layers with precise cell types and arrays of projections. Functional assays revealed the organization of the neuronal networks in node assemblies and modules, with precise connectivity schemes10,11. The role of connectivity and microcircuit motifs cannot, however, be studied adequately in vivo due to the sheer number of synapses that are involved, as well as the interwoven effects of development and activity-dependent plasticity.
Signal transfer: In in vivo or random in vitro cultures, it is challenging to assess signal transfer. Examining the axonal conduction and action potential along its length requires guiding neurite outgrowth by surface functionalization or chemical patterning, providing a high signal-to-noise ratio in extracellular readouts of electrical activity12.
Translational relevance: Deciphering the exclusive role of pre- versus post-synaptic elements across pathological conditions requires having access to these elements individually. Modular cultures with constrained connectivity, effectively segregating the pre-and post-synaptic elements, are indispensable tools to this end13.
Several methods exist to obtain some form of structure in neuronal culture. They can be broadly categorized as chemical and physical surface manipulation9. The former methods14,15 rely on the propensity of neuronal cells to attach to certain (bio)chemical compounds. This requires depositing adhesive or attractive molecules on a surface with micro-scale precision and following a detailed pattern. While this allows a partial coverage of the surface of the cells, following the desired pattern, chemical methods are inherently limited and have a relatively low success rate in neurite growth guidance16. Full control over axon directionality requires establishing a spatial gradient of ad-hoc chemicals to shape axonal guidance17. The latter methods involve physical surface manipulation and are more commonly used to structure the neuronal networks in vitro. Neuronal cells are physically constrained at desired locations by geometrical confinements, such as microscopic chambers, walls, channels, etc., shaping a biocompatible polymer such as polydimethylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 cured and solidified into a microfluidic device. The de facto method for PDMS microfluidic fabrication is soft photolithography21, where a two-dimensional mask is patterned at a micro-scale and employed to selectively etch a silicon-based material upon UV exposure. In a nutshell, a UV-curable resin (i.e., photoresist) is coated onto a silicon wafer through spin-coating, reaching a specific height determined by its viscosity and spinning speed. Then, the patterned mask is positioned over the photoresist and exposed to UV light. Transparent areas within the mask, corresponding to regions of interest, will let UV light induce localized crosslinking of the photoresist molecules. The areas of unexposed photoresist are washed away using a solvent, resulting in the formation of a master mold. This is repeatedly used to bake an elastomer of the choice (i.e., PDMS), which is then engraved with the desired geometries in as many replicas as desired. Such a manufacturing method is the most common method to fabricate microfluidic devices22. Perhaps the main limitations of soft photolithography are the prerequisite of notable capital investment and the unfamiliarity of biological labs with the required techniques and expertise. The preparation of the mask and the steps of soft photolithography required to design complex multiple-height high aspect ratio geometries are non-trivial23 and often require outsourcing. Even though alternative and low-budget methods have been proposed, they do not always satisfy the high precision requirements of biological prototyping24.
Here, an alternative manufacturing method is presented, relying on two-photon polymerization (2PP) and additive manufacturing. It is straightforward and does not require per se advanced microfabrication and microphotolitography expertise. The research field of 2PP micromanufacture emerged in the late 90&#39;s25, and since then, it has witnessed exponential growth26. More about the fundamental principles of this technique can be found elsewhere26. Briefly, by focusing the excitation light impulse in three-dimensional space, 2PP leverages the nonlinear dependence of multiphoton absorption on intensity. This grants the capability of confined absorption, ensuring precise and selective excitation within very localized regions. In essence, a negative-tone photoresist, a material with decreased solubility upon light exposure, is subjected to a focused beam of femtosecond laser pulses at a low duty-cycle27. This allows for impulses with high intensities at low average powers, enabling polymerization without harming the material. The interaction of photo-induced radical monomers gives rise to radical oligomers, initiating polymerization that extends throughout the photoresist up to a distinct volume, i.e., voxel, whose size depends on the intensity and duration of the laser pulses28.
In this work, two components are presented: A) the design and rapid fabrication of a 3D-printed mold, reusable many times to produce disposable polymeric neuronal cell culture devices (Figure 1), and B) their mechanical coupling onto the surface of planar neuronal cell culture substrates, or even of substrate-integrated microelectrode arrays capable of multisite recordings of bioelectric signals.
Computer Assisted Design of a 3D mechanical model is very briefly described here and accompanied by the steps leading to a 3D-printed mold and fabricating PDMS devices is also detailed.
A variety of computer-aided design software applications can be used to generate the starting 3D object model and produce a STL file to control the 2PP printing process. Within the Table of Materials, the first and the last applications listed are free-of-charge or provided with a free license. Constructing a 3D model always requires creating a 2D sketch, which is then extruded in subsequent modelling steps. To demonstrate this concept, a generic 3D CAD software design process is highlighted in protocol section, leading to a structure made of overlapping cubes. For more comprehensive information, a number of online tutorials and free training resources are available, as indicated in the Table of Materials.
The resulting STL file is then translated into a series of commands to be executed by the 3D-printer (i.e., slicing procedure). For the specific 2PP 3D-printer in use, the software DeScribe is used to import the STL file and convert it into the proprietary General Writing Language (GWL) format. The success of 2PP printing process hinges on various parameters, notably, laser power and its scan speed, stitching, and hatching-slicing distances. The choice of these parameters, along with the selection of objective and photoresist, depends on the design&#39;s smallest features, as well as the intended application. Thus, parameter optimization becomes essential to meet the requirements of different design scenarios and use cases. For this work, the recommended recipe IP-S 25x ITO Shell (3D MF) has been considered as a configuration for the printing parameters. Ultimately, a mechanically stable printed part is printed with the necessary resolution while minimizing its 3D-printing time.
The mold design and related STL file, demonstrated in this work, comprises a square frame to segregate the space of a cell culture in two compartments: an outer area (i.e., referred to as Source subsequently) and an inner area (i.e., referred to as Target subsequently). These two compartments are connected through sets of microchannels, each characterized by sharp-angle borders, designed to specifically hinder the growth of neurites from the Target to the Source, but not vice versa, and as such promote a directional synaptic connectivity between neurons growing on the two areas.
Earlier studies employed different geometries of microchannels to encourage the directional growth of neurites. Examples include triangular shapes18, channel barbed structures19, and tapering channels20. Here, a design featuring sharp angle barriers across the microchannel&#39;s borders is employed, characterized also by asymmetric entrances. These microchannels serve to establish continuity between an enclosed interior, the Target compartment, and the external area, the Source compartment. The funnel shape of the initial part of the microchannels, from the Source side, is designed to promote the formation of axonal bundles and their growth along the shortest, i.e., straight line, path connecting the Source to the Target. The triangular space realized by facing sharp angles have larger volume at the Target side to aim at effectively delaying neurites&#39; pathfinding while favoring the rapid shooting of bundles originating from the Source and occupation of the available space. The choice of 540 &#181;m for the length of the microchannels effectively filters out the generally shorter dendritic outgrowth39. In addition, their 5 &#181;m height prevents cell somata from penetrating through the microchannels. Overall, this configuration proved to promote unidirectional connectivity between the outer, Source, and inner, Target modules, and it is presented here as a proof-of-principle among the many alternative choices.
While the PDMS devices, fabricated by the 2PP mold, can be attached to the surface of common cell culture substrates, such as glass coverslips or Petri dishes, in this work commercially available substrate-integrated microelectrode arrays were used. No effort has been made to optimize the 3D design to the microelectrode array layout, and the mechanical coupling was performed under stereomicroscopy guidance aiming only at positioning the device across the array, leaving some microelectrode uncovered in both sides, the Source and the Target. This enables the preliminary assessment of the functional consequences of the constrained connectivity in neuronal cell cultures.

מחבר זרקור: רשתות עצביות מודולריות לניתוח תפקודי מוח

פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני

We are broadly interested in the relationship between structural and functions in the brain, particularly at the level of micro-circuits. We often employ reduced experimental preparations such as dissociated neuron cell culture because they are a precious model to investigate electrical activity, synaptic transmission, and overall, the emergence of collective states. The method we propose is ideal for rapid fabrication of microscale, polymeric devices.This can be immediately used for the experimental study of modular neural networks in a dish, and it do not requires a high level of technical expertise in soft photolithography. This method and our simple proof of concept allow the designing of modular neuronal networks where we can define the structure, and control the flow of biological signals. Drug screening and investigation of pathological conditions immediately benefit from these sophisticated in vitro neuronal networks.

כאן מדווח על ייצור של התקן תרבית תאים פולימרי (עצבי) בעל 2 תאים, המדגים את השימוש בהדפסת תלת-ממד 2PP לאב-טיפוס מהיר של התקני PDMS. באופן ספציפי, מכשיר מיוצר עבור רשתות נוירונים מודולריות עם קישוריות סינפטית חד כיוונית והאפיון התפקודי שלו מוצג במונחים של אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית מרובת אתרים. בקצרה, תבנית בקנה מידה מיקרומטרי מומשה באמצעות כתיבה לייזר ישירה, באמצעות מדפסת תלת מימד זמין מסחרית. בפרט, המדפסת מספקת הספק של 50 mW באמצעות פולסי לייזר עם אורך גל מרכזי של 780 ננומטר ומשך של 80 עד 100 fs. במהלך תהליך הייצור, קרן הלייזר ממוקדת דרך המטרה (25x, NA=0.8) של המדפסת אל photoresist בגוון שלילי (IP-S) כדי לסרוק את נפח ההדפסה באמצעות סורק galvo עבור צירי x ו- y, ואת שלב piezo עבור ציר z. נפח ההדפסה פוצל כראוי לבלוקים של 200 מ"מ x 200 מ"מ x 265 מ"מ כדי לממש תבנית בגודל כולל של 6500 מ"מ x 6500 מ"מ x 545 מ"מ ונפח נומינלי של 12.423 מ"ל. איור 2A מייצג סקיצה דו-ממדית של התבנית, המדגישה את מידותיה ואת גודל תכונותיה, ואילו איור 2B מציג תמונת תקריב של המכשיר המוגמר המורכב על MEA. התבניות שהוכנו כמתואר בסעיף הקודם היו עמידות וניתן היה לעשות בהן שימוש חוזר יותר מ-50 פעמים לייצור מכשירי PDMS.
התבנית המודפסת שימשה ליציקת התקן PDMS, שהורכב לאחר מכן על האזור הפנימי של מערכים משולבים של מצע זכוכית של מערכי מיקרואלקטרודות (MEA), כדי לשמש להקלטות חוץ-תאיות מרובות אתרים של פעילות חשמלית עצבית וכהוכחה עקרונית. MEAs משולבים במצע מסחרי שימשו לניטור הפעילות של תרביות מודולריות בתגובה לגירויים חשמליים מקומיים מרחביים המועברים מחוץ לתא על ידי תת-קבוצה של מיקרואלקרוד הממוקמת בכל תא תרבית. כל MEA מכיל 120 מיקרואלקטרודות טיטניום חנקתי (TiN) בקוטר של 30 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר בין אלקטרודות. איור 2C-D מראה את המיקום של התקן PDMS בחלק העליון של MEA. המאפיינים הגיאומטריים של מיקרו-ערוצים בודדים של המכשיר, יחד עם טביעת הרגל הכוללת של החדר שמוצגת באיור 2C, מובילים למידור של תאי העצב בתרבית. ניתן להבחין ביניהם על פי התא אליו הם שייכים, באזור החיצוני (מקור) המכשיר, או באזור הפנימי (יעד) של המכשיר. ההנחיה האקסונלית המועדפת, המוגבלת מהמקור למטרה, מוכתבת על ידי הקצוות החדים של המיקרו-ערוצים. איור 2D מראה את המיקום של ההתקן הפולימרי באזור המזרח התיכון וצפון אפריקה ואת אזור הכיסוי היחסי של אלקטרודות הקלטה הממוקמות בתאי המקור או המטרה. שים לב שיישור מדויק של החלק הפנימי של המיקרו-ערוצים של המכשיר לשורה אחת או יותר של מיקרואלקטרודות MEA לא נדרש למקרה המבחן שלנו ולא נמשך.
עדות מייצגת לגדילה אסימטרית של נוריט מסופקת באיור 3, במהלך התפתחות ex vivo, המראה נוירוריטים מתויגים פלואורסצנטית בדימות חי, 6 ימים (איור 3A) ויומיים לאחר ציפוי התאים (איור 3B-D). בעוד שתאי העצב בצד המטרה של המכשיר נתקלו במחסומי זווית חדים כמכשולים המעכבים את התקדמותם במרחב, הנוירוטים שמקורם בצד המקור גדלו ללא הפרעה וחצו את הערוצים. אסימטריה זו מעדיפה קשר אקסונלי חד-כיווני בין תאי עצב בשני התאים, המקרין ממקור למטרה, כפי שנאמר במפורש בתכנון. תוצאה זו נתמכת גם על ידי הערכה אלקטרופיזיולוגית (פונקציונלית) של תגובות חשמליות המתעוררות על ידי גירויים המועברים לחלופין בכל אחד משני התאים.
לאחר 3-4 שבועות במבחנה, כאשר הרשתות העצביות הגיעו לבשלות מלאה29,30, ניתן היה לבדוק את הקישוריות התפקודית בין שני התאים על ידי מתן גירויים חשמליים קצרים וניטור התגובות העצביות שהם עוררו31. דחפים חשמליים דו-פאזיים עם משרעת של 800 mV יושמו אז לחלופין רק על המקור או רק על אוכלוסיות היעד (N חזרות = 150, N תרביות מודולריות = 6), שהועברו על ידי 3 זוגות של מיקרואלקטרודות מישוריות בתצורה דו-קוטבית, ובאופן משולב. לכן, 3 זוגות האלקטרודות יכולים להיות ממוקמים באזור המקור של MEA או בתוך אזור המטרה של MEA. התגובות החשמליות המתעוררות על ידי כל גירוי יכולות להיות מזוהות על ידי כל מיקרואלקטרודות MEA לאחר עיכוב התפשטות. ההקלטות בוצעו בקצב דגימה של 25 קילוהרץ לערוץ, והאותות החשמליים הגולמיים החוץ-תאיים שהתקבלו עברו דיגיטציה ברזולוציית המרה אנלוגית לדיגיטלית של 16 סיביות. אלגוריתם זיהוי שיאחוצה סף 32 שימש במצב לא מקוון כדי לזהות את זמן ההתרחשות של פוטנציאלי פעולה חוץ-תאיים, מבלי לבצע מיון ספייק. איור 4A-B חושף בבירור אסימטריה חזקה של תגובות מעוררות, החוזרות על עצמן 150 פעמים, בהתאם למיקום העברת הגירוי, מה שמרמז על השפעה תפקודית משמעותית של האילוצים הגיאומטריים על הכיווניות המועדפת של קישוריות. למעשה, עם גירוי צד המקור, קצב הירי של אוכלוסיית תאי העצב של המקור - המוערך על ידי חישוב ההיסטוגרמה של ספייק-גירוי-פעמים - גדל כצפוי ויצר פרץ רשת מלא של פוטנציאלי פעולה 33,31,34 ואחריו הוא, לאחר עיכוב, עלייה בקצב הירי של אוכלוסיית היעד. עם זאת, ככל שהגירוי הועבר בתוך אוכלוסיית היעד, רק קצב הירי של אוכלוסיית היעד גדל ואוכלוסיית המקור נותרה שקטה ברובה. איור 4C-D חוזר על אותה פרדיגמת גירוי/תגובה בתרבית ביקורת, ללא נוכחות מכשיר פולימרי (כלומר, תרבית עצבית לא מובנית), הגירויים החוץ-תאיים הועברו גם הם במשך 4 חזרות. עבור תנאי בקרה כאלה, לא התרחשה אסימטריה בתגובות שעוררו שני הגירויים. בעוד שתת-הקבוצה של מיקרואלקטרודות MEA המשמשות להעברת הגירויים תאמה לזו המשמשת ברשתות מודולריות, המיקום של העברת הגירוי הוביל לתגובה מעוררת דומה מכלל האוכלוסייה. זה מאשר כי התקן PDMS העדיף קישוריות סינפטית חד-כיוונית, על פני שני התאים. באופן כללי, תגובות אסימטריות המתעוררות בתרביות מודולריות (N = 6) ותגובות סימטריות המתעוררות בתרביות ביקורת (N = 4) מצביעות בבירור על קישוריות אנטומית מוגבלת של מערכת מבחנה ממודרת. הנתונים האלקטרופיזיולוגיים והסקריפטים ששימשו ליצירת איור 4 זמינים באמצעות Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig01.jpg"> איור 1: סקיצה של ייצור מיקרו-עובש 2PP והעתק PDMS. (A) מודל תלת-ממדי מתוכנן ב-CAD ומיוצא בקובץ בפורמט Standard Tessellation Language (STL ), (B) מורה על הדפסת תלת-ממד של 2 פוטונים באמצעות פילמור המושרה בלייזר בתוך טיפת שרף (IP-S). (C) המבנה המתקבל משמש כתבנית לייצור חוזר ונשנה של העתקי PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig02.jpg"> איור 2: דוגמה לאב-טיפוס מהיר פנימי של התקן PDMS פולימרי (עצבי) בתרבית תאים. (A) תוך פחות מ-24 שעות, ייצור תוספים בקנה מידה זעיר מאפשר מעבר ממודל CAD למאסטר מודפס בתלת-ממד, לשימוש מיידי, ושוב ושוב, כתבנית העתק עם אלסטומרים תואמים ביולוגית, כגון PDMS. (ב-ג) התקני PDMS המתקבלים מצומדים למצע מישורי של תרבית תאים עצבית, המיוצג כאן על ידי מערך של מיקרואלקטרודות. עבור תכנון הדגימה הספציפי ב- (A), מוגדרים שני תאים: אחד המכונה מקור ומסומן על ידי S, והשני מכונה מטרה ומסומן על ידי T. (D) תאי עצב המצופים בכל תא יכולים לגדל את הנוירוטים שלהם רק באמצעות סדרה של מיקרו-ערוצים. כאשר הן מיושרות כראוי תחת הנחיית מיקרוסקופ סטריאו ב- (C), שתי קבוצות של מיקרואלקטרודות משולבות מצע נותרות חשופות, כך שניתן לגרות ולהקליט את הפעילות הביו-חשמלית של תאי עצב סמוכים הממוקמים בשני התאים. שימו לב כאן שיישור מיקרואלקטרודות בתוך מיקרו-ערוצים בודדים לא היה בראש סדר העדיפויות של הוכחת עיקרון זו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig03.jpg"> איור 3: הדמיה חיה של מולקולות כתב פלואורסצנטיות של תאים מזהה נוירונים מוארכים על-ידי תאי עצב, כמה ימים לאחר ציפוי התא. (א-ד) מיקרוגרפים פלואורסצנטיים קונפוקליים מייצגים של תרביות עצביות מודולריות של המכשיר שיוצר מאיור 1 ומאיור 2 (N=4, 128 מיקרו-ערוצים בודדים) נרכשו יומיים ושישה ימים לאחר ציפוי התאים. (ב-ד) הגדלה של פי 40 וסולם אפור הפוך של המיקרוגרפים לנראות מוגברת. הסיומות של המיקרו-ערוצים מתאי המקור והיעד מסומנות ב-S וב-T, בהתאמה. (A) מראה את תמונת הסריקה הרחבה של התרבית, כאשר המקור (כלומר, השטח הריבועי הפנימי) והיעד (כלומר, האזור החיצוני) מלאים בתאים, 6 ימים לאחר הציפוי. (B) ו- (C) מציגים, בנקודת הזמן המוקדמת יותר של יומיים לאחר הציפוי, את צמיחת הנוירוטים במקור ובצדדי המטרה של המיקרו-תעלות, בהתאמה. המשולשים השחורים הקטנים מצביעים על דוגמאות מייצגות של צרורות אקסונים משוערים, שמקורם כנראה רק במקור. גבולות המיקרו-ערוצים בצורת החץ מצביעים על התארכות של תאי עצב לאורך הקצה (B), שם המעבר שלהם הוא ללא הפרעה ומונחה לעבר המטרה. בכיוון ההפוך, וליד קצה המטרה של מיקרו-ערוץ (C), נוירוטים שמקורם במטרה ומתקדמים לצד המקור לכודים בפינות החדות. (D) חושף עוד יותר את הפרטים של צמיחת עצבים בתוך מיקרו-ערוץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66142/66142fig04.jpg"> איור 4: אפיון תפקודי של תגובות חשמליות עצביות, עם ובלי התקן PDMS. MEAs שימשו כמצעי תרבית תאים ושימשו למדידת תגובות הספייקינג ברחבי הרשת המתעוררות על ידי פולס גירוי חשמלי דו-פאזי קצר מאוד (כלומר, 200 μs, 0.8V), המועבר בתצורה דו-קוטבית. במכשיר PDMS באיור 2, תגובות הספייקינג העצביות שתועדו מהמקור (אדום) ומהמטרה (כחול) משתנות, כתלות במיקום שבו הגירוי מועבר. עיכובים אקסונליים, סינפטיים ועיכובי אינטגרציה מתגלים ב- (A) אך לא ב- (B), דבר המצביע על קיומה של קישוריות סינפטית מועדפת (כלומר, ממקור למטרה). (ג-ד) בתנאי בקרה (כלומר, ללא התקן PDMS), תגובות מעוררות המזוהות בשתי קבוצות נפרדות של מיקרואלקטרודות MEA אינן תלויות במיקום אספקת הגירוי. ההצללה החיוורת, העוטפת את הקווים בחלקות, מציינת את שגיאת התקן המיידית של הממוצע (N גירויים = 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/66142fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שם הפתרון</td>
			<td colspan="3">הרכב</td>
		</tr><tr><td>פוליאתילנאמין (PEI) 0.1%</td>
			<td colspan="3">1 מ"ל של תמיסת מלאי PEI, 9 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (DI).</td>
		</tr><tr><td>מדיום תרבות (50 מ"ל)</td>
			<td colspan="3">Minimum Essential Medium (MEM), בתוספת 20 מיקרומטר גלוקוז, 50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 50 מיקרומטר L-גלוטמין ו-10% סרום סוסים מומת חום.</td>
		</tr><tr><td>דיסקציה בינונית (1000 מ"ל)</td>
			<td colspan="3">הנקס′ מלחים מאוזנים 9.52 גרם, סודיום ביקרבונט 350 מ"ג, HEPES 2.83 גרם, D-(+)-גלוקוז 6 גרם, חומצה Kynurenic (ריכוז סופי 200 μM), D-AP5 (ריכוז סופי 25 μM), Gentamicin 250 μl, אלבומין סרום בקר 300 מ"ג, מגנזיום גופרתי 1.44 גרם. יש לכוונן את רמת החומציות ל-7.3, להגן מפני אור ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.</td>
		</tr><tr><td>עיכול בינוני (100 מ"ל)</td>
			<td colspan="3">נתרן כלורי 800 מ"ג, אשלגן כלורי 37 מ"ג, די-נתרן מימן פוספט 99 מ"ג, HEPES 600 מ"ג, סודיום ביקרבונט 35 מ"ג, חומצה Kynurenic, 200 μL (ממלאי 100 mM), D-AP5 100 μL (ממלאי 25 mM). כוונן את ה- pH ל- 7.4, הגן מפני אור ואחסן ב- 4 ° C.</td>
		</tr><tr><td>פתרון 1</td>
			<td colspan="3">טריפסין 5 מ"ג, Deoxyribonuclease I 1.5 מ"ג, ב 2 מ"ל של מדיום העיכול.</td>
		</tr><tr><td>פתרון 2</td>
			<td colspan="3">מעכב טריפסין 5 מ"ג, ב 5 מ"ל של מדיום דיסקציה.</td>
		</tr><tr><td>פתרון 3</td>
			<td colspan="3">Deoxyribonuclease I 1.5 גרם, ב 2.5 מ"ל של מדיום דיסקציה.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: טבלת פתרונות. עיין בטבלת החומרים לקבלת תיאורי מוצרים.
קובץ קידוד משלים 1: קובץ התכנון STL מתאים למבנה המתואר באיור 2A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66142/binary.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...

אנו מתעניינים באופן נרחב בקשר שבין מבנים ותפקודים במוח, במיוחד ברמת המיקרו-מעגלים. לעתים קרובות אנו משתמשים בתכשירים ניסיוניים מופחתים כגון תרבית תאי נוירון מנותקת מכיוון שהם מודל יקר ערך לחקר פעילות חשמלית, שידור סינפטי, ובאופן כללי, הופעתם של מצבים קולקטיביים. השיטה שאנו מציעים אידיאלית לייצור מהיר של התקנים פולימריים בקנה מידה מיקרו.זה יכול לשמש באופן מיידי למחקר ניסיוני של רשתות עצביות מודולריות בצלחת, וזה לא דורש רמה גבוהה של מומחיות טכנית פוטוליתוגרפיה רכה. שיטה זו והוכחת ההיתכנות הפשוטה שלנו מאפשרות תכנון של רשתות נוירונים מודולריות שבהן אנו יכולים להגדיר את המבנה ולשלוט בזרימת האותות הביולוגיים. סינון תרופות וחקירה של מצבים פתולוגיים מפיקים תועלת מיידית מרשתות עצביות מתוחכמות אלה במבחנה.

two-photon-polymerization-3d-printing-micro-scale-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

558 Views.  International School for Advanced Studies. אנו מתעניינים באופן נרחב בקשר שבין מבנים ותפקודים במוח, במיוחד ברמת המיקרו-מעגלים. לעתים קרובות אנו משתמשים בתכשירים ניסיוניים מופחתים כגון תרבית תאי נוירון מנותקת מכיוון שהם מודל יקר ערך לחקר פעילות חשמלית, שידור סינפטי, ובאופן כללי, הופעתם של מצבים קולקטיביים. השיטה שאנ?...

Video: מחבר זרקור: רשתות עצביות מודולריות לניתוח תפקודי מוח

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.