המחברים מבקשים להודות ל &#39;Belluscio לציוד הסרטת ניתוח, ד&#39; קוון לצילום סיוע, ק יו לעריכת וידאו סיוע, וק מקלאוד לכל מוסיקת הרקע. ק&quot;ו מודה לתמיכה הנדיבה של אגף NIMH של תוכניות מחקר מו&quot;פ אזרחיות והגנים, קוגניציה ותכנית פסיכוזה. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית מחקר NIMH ביצוע העצמית (VC, י.י., SMKW) והחטיבה של תכנית מחקר הקלינית והביולוגית של בין חומות NIAAA (VC, RMC, DML).

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש ובריאות בעלי חי ועדת שימוש והיו בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. הכנה לפני הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את כל הכלים במעקר חרוז חם לפני הניתוח מזוהם, לנקות את אתר הניתוח עם אתנול 70%, והניח את כיסוי בד נקי. ללבוש כפפות סטריליות. הרדם את החיה עם 1.2% פתרון מוכן טרי Avertin, בהתחשב ב0.02 מ&quot;ל / גרם, intraperitonially. לחלופין, להרדים בגז isoflurane דרך חרטום, 5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה, עם מעגל נבלות פסיבית. בדקו את רמת ההרדמה באמצעות צובט זנב או בוהן כדי להבטיח הרגעה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את עיניו של בעלי החיים עם משחת עיניים סטרילי, ולהזריק dexamethasone המוכן טרי (0.2 מ&quot;ג / ק&quot;ג) וcarprofen (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) subcutaneously כדי למנוע נפיחות ודלקת מוח 11. לגלח את השיער מעל הגולגולת בין האוזניים, ולחטא את העור עם שיחי פולידין ושלוש ספוגיות מתחלפות של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר החיה בשלב ניתוח stereotaxic עם earbars, עם כרית חימום זרימת מים מתחת לקבוצת בעלי החיים ב 37 ° C. בדוק באופן סדיר רמות ההרדמה של בעלי החיים, ולהשלים את מינון חומר ההרדמה המקורי כנדרשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של Marcaine 0.5% מתחת לעור הקרקפת כדי להרדים את האזור. חתוך העור ולהסיר את דש העור מעל הגולגולת. הסר את קרום העצם ולייבש את האזור עם ספוגיות כותנה נקיות. </li></ol> 2. כירורגיה חלון גולגולת כרונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תרגיל שיניים במהירות גבוהה עם 0.5 מ&quot;מ Burr עדינות להתוות עיגול בקוטר מ&quot;מ 3-5 מעל האזור במוח של עניין. מעת לעת להרטיב את הקידוח עם 0.9% אבק מלוח וברור משם עקר עצם עם ספוגיות כותנה נקיות. אם דימומי העצם, השתמש גרמתיelfoam presoaked עם סליין סטרילי כדי לספוג את הדימום ולחכות שזה ייפסק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שכבת העצם האחרונה הוא הגיע, להרים ולהסיר את אי העצם עם מלקחיים עדינים בקצוות. קבצים מצורפים דורה למדף התחתון של העצם עשויים להיתקל אם החלון חוצה תפר עצם. אלה יש להסיר בעדינות כדש העצם הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רול טבול קצף ג&#39;ל עדינות מעל הדורה נחשפה לניקוי פני השטח שלו ולחכות לדימום dural לעצור צעד קריטי:. לא להמשיך עד שכל דימום dural הפסיק. דם שהופך לכוד בתוך החלון גולגולתי בדרך כלל מוביל לחלון אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם האזור של עניין הוא במיקום שבו הדורה היא עבה במיוחד, הסרת הדורה לעיל זה עשוי להיות נחוץ. אם זה מקרה, בעדינות להפריד את הדורה מפיא למטה עם מלקחיים עדינים מאוד, לעשות חתך קטן בדורה הרימה עם עוד זוג מלקחיים עדינים, ואז לתפוס את הקצוות החתוכים ובעדינותלפצל את הדורה. הדורה היא דקה אבל חזקה, אז ייזהר לא לחתוך את המוח עם הקצוות השלמים של הדורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האזור עם ACSF סטרילית או תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבתי coverslip זכוכית סטרילית (3-5 מ&quot;מ) מעל הדורה או פחז צעד קריטי:. עיקולי הגולגולת מסביב משמעותי אם, השתמש 12 דבק Kwiksil כדי למלא את החללים שבי הדורה או הפחז לא ליצור קשר קרוב עם coverslip באזורים שלא צלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בג&#39;ל cyanoacrylate לכסות דבק אלסטומר ואת הקצוות של coverslip הזכוכית. כיסוי כל הגולגולת החשופה עם ג&#39;ל cyanoacrylate, או בתערובת מלט וkrazyglue שיני צעד קריטי:. אל תאפשרו לאף ג&#39;ל cyanoacrylate כדי לגעת במשטח המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ בר מחוייט מתכת ראש קיבוע בקצה השני של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את החיה לחדר התאוששות חם, לאחר הזרקת intraperitonial של ketoprofen, 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, חצניהול כאב r. המשך משכך כאבים לעוד ימים שלאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבועות של החלמה שלאחר הניתוח, להרדים את החיה עם isoflurane (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה), להרכיב אותה בשלב מיקרוסקופ מחוייט עם מסגרת ראש קיבעון, ובדוק את החלון גולגולתי לבהירות אופטית תחת תאורה עם אור כחול. בהירות כלי דם משטח המוח מעידה מאוד של איכות חלון גולגולתי. אם את קצות כלי הדם מוגדרים בחדות, החלון עשוי להיות שמיש. זמן ההחלמה לאחר הניתוח של השבועות מומלץ לאפשר מספיק זמן לחיה כדי להתאושש מניתוח. חלונות גולגולת בדרך כלל לנקות ולשפר בזמן הזה, ולהישאר שקוף אופטי לשבועות נוספים לחודשים, עד לצמיחה מחודשת של גולגולת או עיבוי של הדורה מדרדרת איכות חלון. </li></ol> 3. פרוטוקול וליזר התנהגות סריקה מיקרוסקופי שני פוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיות עם ג הברורחלונות ranial יהיו חשופים לגירוי סביבתי או נתון לאימון התנהגותי, ולאחר מכן צלמו לאחר מכן בעת ​​הביטוי מקסימאלי Arc-GFP. לפני תחילת פרוטוקול התנהגותי, בעלי החיים צריכים להיות כל זמן בסביבת כלוב הביתה עקבית למזער וריאציה מהיום ליום ברמות ביטוי Arc-GFP בנקודת ההתחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין אימון התנהגותי או פרדיגמות גירוי סביבתיות, בהתאם לאזור במוח של עניין. לדוגמה, בעלי חיים יכולים להיות חשופים לסביבה חזותית שונה על פני ימים רצופים, וצלמו בכל יום לאחר גירוי חזותי כדי לזהות תגובות לגירוי ספציפיים בקליפת המוח הראייתית 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Arc-GFP פלואורסצנטי בנוירונים בדרך כלל יגיע לרמת שיא שעות לאחר גירוי. ציר הזמן הניסיוני עשוי להיות מותאם כדי להקל על זיהוי של ביטוי Arc-GFP בתאי עצב ברמות קרינת השיא שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אימון התנהגותי או environmentaגירוי l הושלם, להרדים את החיה עם isoflurane (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה) ולצאת לחיים בשלב מיקרוסקופ מחוייט עם מסגרת ראש קיבעון מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנוחת הראש של החיה קבועה למסגרת ראש הקיבוע שמתחבר ישירות לבמה, תוך שימוש בסרגל המתכת המושתלת בגולגולת. Isoflurane וחמצן מסופקים ברציפות לעכבר בחרטום. טמפרטורת גוף נשמרת באמצעות כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי גלאי מיקרוסקופ מוגנים מפני אור הסביבה על ידי ביצוע סריקת ליזר שני פוטון בחדר חשוך. השתמש 20x או 25x (1.05 צמצם מספרי) עדשת טבילה במים להדמיה. ראשית, תחת תאורה עלית פלואורסצנטי, לרכוש תמונה של דפוסי כלי הדם על פני השטח מעל האזור במוח עניינים עם מצלמת CCD ליישור תמונת עתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ליזר שני פוטוני סריקה לרכוש מחסנית תמונה 3-D. אולימפוס FV1000מיקרוסקופ רב פוטון MPE משמש בהגדרה שלנו. גל באורך העירור של ליזר שני הפוטונים מוגדר בננומטר 920, ואת כוחו של הליזר המופק ממטרה מוגדר בכ 50 mW. פלואורסצנטי נפלט הוא זוהה במקביל בערוצים ירוקים ואדום (ראי Dichroic ב570 ננומטר, מסנני מכשול ב495-540 ננומטר ו570-625 ננומטר), תוך שימוש במערכת חיצונית שני ערוצי photomutiplier זיהוי הממוקם קרוב לדגימה. Arc-GFP פלואורסצנטי מופיע רק במסלול הירוק, ואילו רקמות האוטומטיות פלואורסצנטי מופיעה בשני ערוצים 13, 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות תמונה אופייניות בממדים של כ 320x320x100 מיקרומטר (רוחב x אורך x עומק), ברזולוציה אופקית של 0.5 מיקרומטר / פיקסלים וברזולוציה אנכית של 3 מיקרומטר / פיקסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שרכש את מחסנית התמונה, להחזיר את בעל חיים לכלוב בבית שלה. אל תפריעו לחיים עד התנהגותית הבאים ומפגש הדמיה. חזור על ההתנהגות והליך הדמיה פני ימים כדסירed. השתמש בתמונה רכשה בעבר במוח פני השטח של כלי הדם כדי לכוון חזרה לאותו מיקום הדמיה. </li></ol>

<ol>
	<li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity.">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li><li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system.">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li><li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression.">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li><li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity.">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li><li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+growth+factor+and+activity-regulated+gene,+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites.">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li><li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity.">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li><li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+Arc,+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity.">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain.">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li><li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist:+a+review+journal+bringing+neurobiology.">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li><li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey.">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

בשיטת הדמית vivo המתוארת כאן מאפשר בדיקה חוזרת של שינויי ביטוי גני Arc באותם סטים של תאי עצב מעל ימים מרובים בחי. זה הוא שיטה יעילה ותכליתית כדי להשיג מידע על דינמיקה מולקולרית הקשורים לפלסטיות עצבית בנוירונים בודדים בתגובה לחוויות התנהגותיות שונות. שיטות סטנ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם הציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> FV1000 מיקרוסקופ סריקת ליזר רב פוטון </td><td> אולימפוס </td><td> FV1000MPE </td><td> הדמיה </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ נתיחה </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> כירורגיה </td></tr><tr><td> שלב הניתוח Stereotaxis לעכברים </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 726335 </td><td> כירורגיה </td></tr><tr><td> 20X או מטרת טבילה במי 25X </td><td> אולימפוס </td><td> XLPL25XWMP </td><td> הדמיה </td></tr><tr><td> שלב מיקרוסקופ עם מסגרת ראש קיבעון </td><td> Custom made </td><td> N / </td><td> הדמיה </td></tr><tr><td> מלקחי פיין </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11251-20 </td><td> כירורגיה </td></tr><tr><td> שיני תרגיל זמזום טורדני </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 19007-05 </td><td> כירורגיה </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> הדמיה </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

יכולתו של המוח להשתנות בתגובה לניסיון חיונית לתפקוד המוח בריא, והליקויים בתהליך זה תורמים למגוון של הפרעות 1,2 המוח. כדי להבין טובים יותר את המנגנונים שבאמצעותם מעגלים חשמליים במוח מגיבים לניסיון של בעל חיים דורש את היכולת לעקוב אחר השינויים המולקולריים חוויה התלויה במערך נתון של נוירונים, על פני תקופה ממושכת של זמן, בחי. למרות הניסיון והפעילות עצבית המשויך לו ידוע לגרום לשינויים בביטוי גני נוירונים 1,2, רוב השיטות כדי לזהות שינויים כאלה אינם מאפשרים התבוננות חוזרת ונשנית של אותם נוירונים מעל ימים מרובים או אין לך רזולוציה מספיקה להתבונן נוירונים בודדים 3 , 4. כאן, אנו מתארים שיטה שמשלבת בvivo מיקרוסקופ שני פוטונים עם כתב ניאון מקודד גנטי כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גני חוויה תלויות בנוירונים בקליפת המוח בודדים מעל<html> במהלך ניסיוני היום יום. אחד מהגנים ומבוססי ניסיון התלויים הוא חלבון פעילות מוסדרת cytoskeletal המשויך (ארק) 5,6. התעתיק של Arc הוא במהירות וביותר הנגרם על ידי פעילות עצבית מוגברת 3, והמוצר שלה החלבון מסדיר אנדוציטוזה של קולטני גלוטמט ופלסטיות ארוכת טווח הסינפטי 7. הביטוי &#39;ארק כבר בשימוש נרחב כסמן מולקולרי למיפוי מעגלים עצביים מעורבים בהתנהגויות ספציפיות 3. במרבית המחקרים אלה, ביטוי ארק זוהה על ידי כלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה בחלקי מוח קבועים. למרות השיטות האלה גילו כי הביטוי &#39;ארק היה מקומי לקבוצת משנה של הנוירונים מעוררים לאחר ניסיון התנהגותי, איך את הדפוסים הסלולר של ביטוי ארק עשויים להשתנות עם אפיזודות מרובות של חוויות חוזרות או ייחודיות מעל ימים לא נחקר. ntent &quot;&gt; בחי מיקרוסקופ שני פוטונים מציע דרך רבה עצמה כדי לבחון שינויים תאיים חוויה תלויה במוח החי 8,9. כדי לאפשר בחינה של ביטוי ארק נוירונים בחיים על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים, יצרו דפיקה בעבר בתור עכבר שבכתב GFP מוצב תחת השליטה של אמרגן ארק אנדוגני 10. פרוטוקול זה מתאר את הכנות כירורגיות ונהלי הדמיה למעקב אחר דפוסי ביטוי Arc-GFP חוויה תלוי בהרכבים עצביים בחי. בשיטה זו , חלונות גולגולת כרוניים היו מושתלים הראשון בעכברי Arc-GFP מעל אזורי קליפת הריבית. אלה חיות אז צלמו שוב ושוב על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים לאחר פרדיגמות התנהגות רצויה במשך כמה ימים. שיטה זו עשויה להיות רלוונטית לכלל בעלי חי נושאים כתבי ניאון אחרים של שינויים מולקולריים ניסיון תלויים 4.

<html> פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר שינויים מולקולריים חוויה תלויה בנוירונים בקליפת מוח בודדים בבעלי חיים. חלון גולגולתי כרוני נוצר לראשונה מעל אזור קליפת מוח של עניין בעכבר נושא כתב ניאון של ביטוי גנים. מיקרוסקופ שני פוטונים אז יכול להיות בשילוב עם פרדיגמות התנהגות...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons at JoVE.com

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.<em&gt; In vivo</emשיטת הדמיה&gt; שני פוטונים מתוארת כאן, המאפשרת מעקב אחר שינויים מולקולריים כאלה בנוירונים בקליפת המוח בודדים באמצעות כתבים מקודדים גנטי.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K Views.  National Institute of Mental Health. שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים. In vivo שני פוטונים מתוארת כאן, המאפשרת מעקב אחר שינויים מולקולריים כאלה בנוירונים בקליפת המוח בודדים באמצעות כתבים מקודדים גנטי.

Video: In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

בVivo שני פוטונים מיקרוסקופית של קצות עצבים בודדים בעור

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

שני פוטונים סימולטני<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של תשומות Synaptic ויעדי Postsynaptic בקליפת עכבר Retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

שני הפוטונים סידן הדמיה של דנדריטים עצביים במוח פרוסות

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...