Diese Studie wurde teilweise durch einen Koch Institute Support Grant Nummer P30-CA14051 des National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), einen Core Center Grant P30-ES002109 des National Institute of Environmental Health Sciences, das Marble Center for Cancer Nanomedicine des Koch-Instituts, das Koch Institute Frontier Research Program über den Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund unterstützt. und der Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A.E.V.H. wird durch ein NIH-finanziertes Predoctoral Training Fellowship (T32GM130546) unterstützt. S.N.B. ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. L.H. wird durch einen K99/R00 Pathway to Independence Award des National Cancer Institute und die Startfinanzierung der Boston University unterstützt.

Alle Tierstudien werden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Einrichtung der Autoren genehmigt. Standard-Tierpflegeeinrichtungen wie Haltungskammern, sterile Hauben, Anästhesie und ethische Endpunkt-Euthanasie sind erforderlich, um diese Experimente ordnungsgemäß durchzuführen. Alle Experimente werden in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Richtlinien durchgeführt und vom tierärztlichen Personal der Einrichtung überwacht. Weibliche BALB/c-Mäuse, die für die Experimente verwendet wurden, stammen aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle) und waren zu Beginn der Studie zwischen 6 und 8 Wochen alt. Sequenzen für kundenspezifisch synthetisierte DNA, crRNA, FRET-basierte Peptidsubstratsonden und Sensorpeptide sind in der ergänzenden Tabelle 1 enthalten.
1. Protease-aktivierte Peptidsubstratauswahl
<ol><li>Entnahme und Aufbereitung von Gewebeproben aus gesunder Lunge oder Lungengewebe mit Tumorknoten nach einem zuvor veröffentlichten Bericht13.<ol><li>Homogenisieren Sie Gewebe in vorgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) (200 mg Gewebe/ml PBS) mit Gewebedissoziationsröhrchen für die automatisierte Dissoziation von Geweben in Einzelzellsuspensionen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 6.000 x g für 5 min bei 4 °C. Bewahren Sie den Überstand in einem neuen Röhrchen auf.</li>
		<li>Der Überstand wird bei 14.000 x g 25 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Fügen Sie der Probe PBS hinzu, um eine Lösung von 0,33 mg/ml herzustellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Beurteilen Sie die proteolytische Aktivität anhand der folgenden Schritte.<ol><li>Geben Sie in einer 384-Well-Platte 5 μl, 6 μM FRET-basierte Peptidsubstratsonden in jedes Well. Führen Sie die Reaktion für jede Sonde in dreifacher Ausführung durch. HINWEIS: Die FRET-basierte Peptidsubstratsonde enthält eine kurze Peptidsequenz (6-8 Aminosäuren, die spezifisch für eine Zielprotease oder eine Gruppe von Proteasen sind), die mit einem Fluorophor- und Quencherpaar abgeschlossen ist. Zwei FRET-Sonden sind in der ergänzenden Tabelle 1 beispielhaft beschrieben. Die vollständige Bibliothek der Sonden finden Sie in Hao et al.13. Urheberrecht</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Well-Platte 10 s lang bei Raumtemperatur bei 180 x g , um sicherzustellen, dass sich die Sonden am Boden der Platte befinden.</li>
		<li>Geben Sie 25 μl 0,33 mg/ml Gewebeprobe oder 40 μM rekombinante Protease13 in jede Vertiefung. HINWEIS: Die Endkonzentration der Gewebeprobe oder der rekombinanten Protease muss möglicherweise entsprechend ihrer intrinsischen proteolytischen Aktivität optimiert werden. Beispielsweise können stark proteolytische Gewebe wie der Darm höhere Verdünnungsfaktoren erfordern, um die anfängliche enzymatische Spaltung überwachen zu können.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Well-Platte kurz bei 180 x g (bei Raumtemperatur), um die Sonden und Gewebelysate zu mischen.</li>
		<li>Beginnen Sie sofort mit der Erkennung der Sondenspaltung, indem Sie die Fluoreszenz mit dem Plattenlesegerät bei 37 °C alle 2 Minuten für 1 h (λz. B. 485 nm; λem: 535 nm) messen, um die Spaltung zu überwachen. HINWEIS: Verwenden Sie die entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen für bestimmte Fluorophor- und Quencherpaare. Im Falle dieser Studie werden Parameter (λex: 485 nm und λem: 535 nm) für das FAM-Fluorophor festgelegt.</li>
		<li>Um die fluoreszierenden Messdaten zu analysieren, verwenden Sie das Python-Paket (siehe Materialtabelle) für die Analyse der Enzymkinetik, das unter https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic verfügbar ist. Dieses Skript berechnet die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit (V0) anhand der Steigung der linearen Anpassung der ersten 8-10 Anfangszeitpunkte.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sensorformulierung und -charakterisierung
<ol><li>Synthetisieren Sie das Konjugat von DNA und Protease-aktiviertem Peptid (PAP).<ol><li>Inkubieren Sie 20-mer-phosphorothioierte DNA-Reporter mit 3'-DBCO-Gruppe (1,1 Äq., siehe Materialtabelle) mit azidterminierten PAPs mit C-terminus-Cystein-Ende in 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) bei Raumtemperatur für >4 h. Bei Übernacht bei 4 °C inkubieren.</li>
		<li>Reinigen Sie das Produkt auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-System (HPLC), das mit einer Säule ausgestattet ist, die sich ideal für Biomoleküle eignet (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den HPLC-Gradienten so ein, dass er bei 5 % A-Puffer (0,05 % TFA in H2O) beginnt, 20 Minuten lang isokratisch bleibt und 80 % B-Puffer (0,05 % TFA, 99,95 % Acetonitril) bei 65 Minuten mit einer Flussrate von 0,3 ml min-1 erreicht, und sammelt das konjugierte Produkt mit einer Retentionszeit von ~31 min.</li>
		<li>Validieren Sie die gereinigten Konjugate durch matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) unter Verwendung von α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure als Matrix14 (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetisieren Sie die DNA-kodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren.<ol><li>2 mg multivalentes PEG (40 kDa, 8-armig, siehe Materialtabelle) mit Maleimid-reaktiver Gruppe in 1 ml 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) und Filter (Cutoff: 0,2 μm) lösen.</li>
		<li>Geben Sie die Cystein-terminierten DNA-Peptid-Konjugate (2 Gl., siehe Materialtabelle) in das PEG und reagieren Sie bei Raumtemperatur für >4 h. Bei Übernacht bei 4 °C inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die nicht konjugierten Materialien mittels Größenausschlusschromatographie mit einer handelsüblichen Dextran-Agarose-Kompositmatrixsäule auf einer schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC) (siehe Materialtabelle). Führen Sie Proben in PBS durch und überwachen Sie die Absorption bei 260 nm für DNA und 280 nm für Peptid.</li>
		<li>Konzentrieren Sie die synthetisierten Nanosensoren mit Zentrifugalfilterröhrchen (MWCO = 10 kDa) gemäß der vom Hersteller empfohlenen Geschwindigkeit (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Quantifizieren Sie die DNA-Konzentration mit einem ssDNA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle) und einem Plattenlesegerät bei λz. B. 485 nm und λem: 535 nm. Lagern Sie die Nanosensoren bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Charakterisieren Sie die DNA-kodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren.<ol><li>Messen Sie die hydrodynamische Partikelgröße von DNA-kodierten Nanosensoren durch dynamische Lichtstreuung (DLS). HINWEIS: Der erwartete Größenbereich von Nanosensoren beträgt 15-50 nm mit einer durchschnittlichen Größe von 20-30 nm. Wenn ein begrenzter Größenbereich gewünscht wird, kann FPLC (in Schritt 2.3) verwendet werden, um schmalere Fraktionen mit unterschiedlichen Molekulargewichten zu isolieren.</li>
		<li>Konzentrieren Sie die Nanosensoren mit Zentrifugalfilterröhrchen (MWCO = 10 kDa) auf 0,5 mg/ml (nach DNA-Konzentration) und laden Sie die Proben auf ein kohlenstofffilmbeschichtetes Kupfergitter, das auf einem Kryohalter montiert ist. Beobachten Sie die Morphologie mit der kryogenen Transmissionselektronenmikroskopie (200 kV, Vergrößerung von 10.000-60.000)14.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sensorinjektion und Urinsammlung
<ol><li>Sammeln Sie Urin für die Basismessung.<ol><li>Setzen Sie die Maus in eine benutzerdefinierte Gehäusekammer (siehe Ergänzende Abbildung 1) mit einer 96-Well-Platte als Basis.</li>
		<li>Halten Sie die Maus fest und üben Sie sanften Druck auf die Blase aus, um den verbleibenden Urin auf die Platte zu entleeren.</li>
		<li>Pipettieren Sie den gesammelten Urin (~100-200 μl) von der 96-Well-Platte in ein 1,5-ml-Röhrchen, nachdem Sie die Maus in das normale Gehäuse eingesetzt haben.</li>
	</ol></li>
	<li>Etablierung eines präklinischen murinen Tumormodells.<ol><li>Beimpfen Sie 6 bis 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse durch intravenöse Injektion mit Luciferase-exprimierender MC26-Fluc-Zelllinie (100.000 Zellen/Maus) (siehe Materialtabelle). Überwachen Sie die Tumorprogression wöchentlich mit einem In-vivo-Fluoreszenzbildgebungssystem. HINWEIS: Eine sichtbare Tumorlast, die durch ein Lumineszenzsignal angezeigt wird, tritt ungefähr in Woche 2 der Injektion dieser speziellen Zelllinie auf. Kontrollieren Sie tumortragende Tiere während der Tumorprogression regelmäßig.</li>
	</ol></li>
	<li>Injektion von Nanosensoren zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Tumorimplantation.<ol><li>Bereiten Sie eine Injektionslösung (200 μl maximales Volumen) vor, die Nanosensoren in einer Konzentration von 1 nmol per DNA-Barcode in sterilem PBS enthält.</li>
		<li>Injizieren Sie 200 μl Sensorlösung in PBS intravenös in jede experimentelle Maus.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie Urinproben von gesunden Kontroll- und tumortragenden Mäusen 1 h nach der Sensorinjektion, wie in den Schritten 1.1-1.3 beschrieben. HINWEIS: Frische Urinproben können direkt zur DNA-Barcode-Analyse verarbeitet oder sofort auf Eis eingefroren werden.</li>
</ol>4. CRISPR-Detektion von DNA-Barcodes: fluoreszenzbasiert
<ol><li>Verwenden Sie frische Urinproben oder tauen Sie gefrorene Proben auf Eis auf. Zentrifugieren Sie Urinproben bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Reagenzien in der ergänzenden Tabelle 2, fügen Sie zuletzt das Cas12a-Enzym (siehe Materialtabelle) hinzu und mischen Sie die Reaktion vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Inkubieren Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 °C.</li>
	<li>Führen Sie die Reporterreaktion, wie in der ergänzenden Tabelle 3 gezeigt, in dreifacher Ausführung mit dem Produkt aus Schritt 2 aus. Fügen Sie die Reaktion aus Schritt 2 zuletzt hinzu und bringen Sie sie schnell in den Plattenleser.</li>
	<li>Nachweis der LbaCas12a-Aktivierung durch Messung der Fluoreszenz mit einem Plattenlesegerät bei 37 °C alle 2 Minuten für 3 Stunden (λz. B. 485 nm und λem: 535 nm), um die Spaltkinetik des DNA-Reporters zu überwachen.</li>
	<li>Um die fluoreszierenden Messdaten zu analysieren, verwenden Sie das Python-Paket für die Analyse der Enzymkinetik, das unter https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic verfügbar ist. Dieses Skript berechnet die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit (V0) anhand der Steigung der linearen Anpassung der ersten 8-10 Anfangszeitpunkte.</li>
</ol>5. CRISPR-Detektion von DNA-Barcodes: papierbasiert
<ol><li>Zentrifugieren Sie Urinproben bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. HINWEIS: Führen Sie die Urinproben für die fluoreszenzbasierte und papierbasierte CRISPR-Detektion parallel durch.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Reagenzien in der ergänzenden Tabelle 2. Bei 37 °C 30 min inkubieren. HINWEIS: Dieser Inkubationsschritt ist identisch mit dem für die fluoreszenzbasierte CRISPR-Detektion.</li>
	<li>Führen Sie die Reporterreaktion mit einem FAM-Biotin-markierten DNA-Reporter für den Lateral-Flow-Assay auf einem Papierstreifen durch (siehe Materialtabelle). Kombinieren Sie die Reagenzien in der ergänzenden Tabelle 4 in einer 96-Well-Platte mit dem Produkt aus Schritt 2. Mit Alufolie abdecken und 1 h bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Wählen Sie die optimale Inkubationszeit entsprechend der Echtzeit-Kinetiküberwachung im oben beschriebenen fluoreszenzbasierten CRISPR-Detektionsassay.</li>
	<li>In eine frische Vertiefung einer 96-Well-Platte 80 μl PBS geben. Geben Sie 20 μl der Probe aus Schritt 3 in diese Vertiefung.</li>
	<li>Legen Sie einen Lateral-Flow-Papierstreifen in jede Vertiefung und warten Sie, bis die Flüssigkeit die Oberseite des Streifens erreicht hat (<5 Minuten). Achten Sie auf das Erscheinungsbild der Kontroll- und/oder Probenbande(n) auf dem Papierstreifen.</li>
	<li>Machen Sie ein Foto des Lateral-Flow-Streifens und quantifizieren Sie die Bandenintensität mit ImageJ.</li>
</ol>

CRISPR-Cas Synthetischer Urin-Biomarker-Test für die Krebsdiagnostik

<ol>
	<li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring.">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li><li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities.">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li><li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology.">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li><li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care.">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+new+dimensions.">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+quantum+dots.">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics.">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics.">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li><li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing.">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216 (2021).</li><li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice.">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li></ol>

S.N.B., L.H. und R.T.Z. sind als Erfinder in einer Patentanmeldung aufgeführt, die sich auf den Inhalt dieses Werks bezieht. S.N.B. hält Anteile an Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio und ist Direktor bei Vertex; berät Moderna und erhält gesponserte Forschungsgelder von Johnson & Johnson, Revitopen und Owlstone.

Hier wird eine hochgradig anpassbare Plattform für die Multiplex-Krebserkennung mit einem tragbaren Urintest vorgestellt, der die krankheitsassoziierte proteolytische Aktivität mit einem minimalinvasiv injizierten Sensor bewertet. Bei Aktivierung durch Tumorproteasen wird die Peptidsubstratspaltung durch DNA-Barcode-Freisetzung in den Urin amplifiziert. Die synthetischen DNA-Reporter in einer Urinprobe können durch eine sekundäre CRISPR-Cas-vermittelte enzymatische Amplifikation mittels fluorometrischer Dete...

Trotz der erheblichen Anstrengungen, Tumor-Biomarker wie abgestoßene Proteine und DNA zu identifizieren, wurde das Feld der Krebsdiagnostik durch ihre geringe Häufigkeit oder ihren schnellen Abbau im Kreislauf belastet1. Als ergänzende Strategie stellen biotechnologisch hergestellte synthetische Biomarker, die selektiv auf Krankheitsmerkmale reagieren, um verstärkte Signale zu erzeugen, neue Wege zu einer genauen und zugänglichen Diagnostik dar 2,3. Um die Erkennung zu unterstützen, nutzen diese synthetischen Biomarker tumorabhängige Aktivierungsmechanismen wie die enzymatische Amplifikation, um Analyten mit verbessertem Signal-Rausch-Verhältnisherzustellen 4. Hierbei wird eine Klasse von krebsassoziierten Enzymen, Proteasen, genutzt, um injizierbare nanoskalige Sensoren zu aktivieren, um Krankheitsreporter freizusetzen, die aus den Bioflüssigkeiten wie Blut oder Urin nachweisbar sind 5,6. Angesichts der Tumorheterogenität ermöglicht die Entwicklung eines Panels von Protease-aktivierten Sensoren Multianalyttests, die verschiedene Protease-Spaltungsereignisse zu einer "Krankheitssignatur" kombinieren, um die Krebsinzidenz und -progression auf spezifischere, multiplexe Weise zu bewerten.
Es wurden Protease-aktivierte synthetische Biomarker entwickelt, die Peptidsubstrate umfassen, die an die Oberfläche eines inerten Trägerskonjugiert sind 7. Wenn diese Peptide in vivo injiziert werden, werden sie zum Tumor transportiert, woraufhin die enzymatische Spaltung durch Tumorproteasen Reporter zum Nachweis in Blut oder Urin freisetzt. Der Multiplex-Nachweis mit Protease-aktivierten synthetischen Biomarkern erfordert, dass jeder synthetische Biomarker in einem Cocktail mit einem eindeutigen molekularen Barcode gekennzeichnet wird. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Ansätze entwickelt, darunter Massen-Barcodes und ligandenkodierte Reporter 8,9,10. Im Gegensatz zu diesen Multiplexing-Methoden, die auf wenige verschiedene Signalmöglichkeiten beschränkt sein können, bietet DNA-Barcoding viel mehr Kombinationen, die der hohen Komplexität und Heterogenität menschlicher Krankheitszustände entsprechen. Um die Multiplexität synthetischer Biomarker zu erweitern, werden die Sensoren mit einem Barcode versehen, indem jeder Reporter mit einer eindeutigen DNA-Sequenz markiert wird, die über die CRISPR-Cas-Nuklease nachgewiesen werden kann, um das biofluidische Signal ex vivo zu verstärken. Diese einzelsträngigen DNA-Barcodes (ssDNA) sind so konzipiert, dass sie an komplementäre CRISPR-Guide-RNAs (crRNAs) binden und die zielgesteuerte kollaterale Nukleaseaktivität von CRISPR-Cas12aaktivieren 11. Diese Nukleaseaktivität kann verwendet werden, um einen Reporter-DNA-Strang zu spalten, der durch Fluoreszenzkinetik oder unter Verwendung von Papierstreifen nachgewiesen wird.
Neben der molekularen Amplifikation über Proteasen (in vivo) und CRISPR-Cas (ex vivo) besteht ein weiteres wichtiges Designmerkmal von Protease-aktivierten synthetischen Biomarkern darin, die Pharmakokinetik von Nanomaterialien zu nutzen, um die diagnostische Signalkonzentration in Bioflüssigkeiten zu erhöhen10. Ein Ansatz ist die Verwendung eines Nanopartikelträgers, um die Zirkulationszeit von oberflächenkonjugierten Peptidsubstraten zu erhöhen. Ein Polyethylenglykol (PEG)-Dendrimer wird als Nanocarrier mit relativ kleinem hydrodynamischem Durchmesser und Multivalenz ausgewählt, um die Abgabe an Tumore zu erhöhen. Obwohl er klein genug ist, um die Tumorabgabe zu fördern, ist die Größe des PEG-Trägers größer als der ~5-nm-Grenzwert der glomerulären Nierenfiltrationsbarriere, so dass nur gespaltene Peptidsubstrate in den Urin ausgeschieden werden können, wobei die Größenfiltration durch die Nieren genutzt wird12. In diesem Protokoll wird der mehrstufige Arbeitsablauf für die Synthese und Anwendung von DNA-barcodierten aktivitätsbasierten Nanosensoren in einem präklinischen Mausmodell skizziert, wobei der Aufbau des CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Tests hervorgehoben wird, der von dieser Gruppe zur Klassifizierung des Krankheitsstatus in Mausmodellen mehrerer Krebsarten eingesetzt wurde13. Aufgrund des vielseitigen Designprinzips können alle drei Funktionskomponenten des Nanosensors - der Nanocarrier (PEG-Polymer), das stimuli-responsive Modul (Protease-aktiviertes Substrat) und der biofluidische Reporter (DNA-Barcode) - je nach anwendungsspezifischen Anforderungen präzise ausgetauscht werden, was eine Modularität durch maßgeschneiderte Ziel- und Freisetzungsspezifitäten ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x NEB Buffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6002SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3&#8217;-DBCO group</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column</td>
			<td>&#160;Agilent</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td></td>
			<td>Various volumes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic transmission electron microscopy</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>cyroTEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine terminated DNA-peptide conjugates</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &#181;M</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental animals</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td>BALB/cAnNTac</td>
			<td>6&#8211;8&#8201;weeks of age</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>MGHD 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization&#8211;time of flight (MALDI&#8211;TOF) mass spectrometry&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex MALDI&#8211;TOF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC26-Fluc cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python, Version 3.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.python.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O11492</td>
			<td>ssDNA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA FAM-T10-Quencher and&#160; FAM-T10-Biotin reporter substrates</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td>For FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite Pro M200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas-mediated multianalyte synthetic urine biomarker test for portable diagnostics

Die Entwicklung synthetischer Biomarker für die Entwicklung von Präzisionsdiagnostika hat die Erkennung von Krankheiten über Wege ermöglicht, die über die für herkömmliche Biofluidmessungen verwendeten hinausgehen. Synthetische Biomarker verwenden im Allgemeinen Reporter, die lesbare Signale in der Bioflüssigkeit liefern, um die biochemischen Veränderungen in der lokalen Krankheitsmikroumgebung während des Auftretens und Fortschreitens der Krankheit widerzuspiegeln. Die pharmakokinetische Konzentration der Reporter und die biochemische Amplifikation des Krankheitssignals sind von größter Bedeutung, um eine hohe Sensitivität und Spezifität in einem diagnostischen Test zu erreichen. Hier wird eine Krebsdiagnoseplattform mit einem Format synthetischer Biomarker aufgebaut: aktivitätsbasierte Nanosensoren, die chemisch stabilisierte DNA-Reporter tragen, die durch aberrante proteolytische Signaturen in der Tumormikroumgebung freigesetzt werden können. Synthetische DNA als Krankheitsreporter bietet Multiplexing-Fähigkeit durch ihre Verwendung als Barcode, die das gleichzeitige Auslesen mehrerer proteolytischer Signaturen ermöglicht. DNA-Reporter, die in den Urin freigesetzt werden, werden mit Hilfe von CRISPR-Nukleasen durch Hybridisierung mit CRISPR-RNAs nachgewiesen, die wiederum bei Enzymaktivierung ein fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal erzeugen. In diesem Protokoll werden DNA-Barcode-basierte, aktivitätsbasierte Nanosensoren konstruiert und ihre Anwendung in einem präklinischen Mausmodell für metastasierenden Darmkrebs veranschaulicht. Dieses System ist je nach Krankheitsbiologie in hohem Maße modifizierbar und erzeugt mehrere Krankheitssignale gleichzeitig, was ein umfassendes Verständnis der Krankheitsmerkmale durch einen minimalinvasiven Prozess ermöglicht, der nur die Verabreichung von Nanosensoren, die Urinsammlung und einen Papiertest erfordert, der eine Point-of-Care-Diagnostik ermöglicht.

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung molekularer Werkzeuge für die Erkennung und Bildgebung von Krankheiten

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Nominierung von Protease-aktivierten Peptidsubstraten Um Sensoren zu entwerfen, die Veränderungen in der proteolytischen Aktivität des Gewebes widerspiegeln, wird die Proteaseaktivität im Gewebe zunächst mit einer Bibliothek von Peptidsonden13 charakterisiert (Abbildung 1). Frische und gefrorene Gewebeproben können wesentliche Informationen über die proteolytische Aktivität der Tumormikroumgebung liefern, indem Gewebeproben mit FRET-Sonden k...

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Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Das Heart Lab entwickelt molekulare und zelluläre Werkzeuge, um die Krankheitsbiologie präzise zu verfolgen und zu kontrollieren. Wir verwenden spezielle Informationen über erkrankte Gewebe, um die Entwicklung von reaktionsschnellen Erkennungs-, Bildgebungs- und Behandlungswerkzeugen für heterogene Erkrankungen zu unterstützen. Bioflüssigkeiten bieten eine bequeme Möglichkeit zur Erkennung und Bewertung von Krankheiten, die jedoch oft durch geringe Mengen relevanter Analyten begrenzt sind.Infolgedessen verfolgt ein Großteil des Feldes Strategien zur Verstärkung krankheitsassoziierter Signale, um die Empfindlichkeit diagnostischer Tests wie BCR und Oberflächenplasma auf Resonanz zu verbessern. Anstatt sich auf endogene Krankheitsbiomarker im Umlauf zu verlassen, verwendet unser Ansatz synthetische Biomarker, um die Krankheitsaktivität zu melden, wenn sie von injizierten Nanosensoren freigesetzt werden. Unsere synthetischen Biomarker sind chemisch stabilisierte DNA-Barcodes, die es ermöglichen, mehrere Signale der Krankheitsmikroumgebung gleichzeitig zu erkennen und mit dem entsprechenden Barcode zu identifizieren.

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Bioengineering

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

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Serie: Autor im Rampenlicht: Entwicklung molekularer Werkzeuge für die Erkennung und Bildgebung von Krankheiten

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for traditional biofluid measurements. Synthetic biomarkers generally make use of reporters that provide readable signals in the biofluid to reflect the biochemical alterations in the local disease microenvironment during disease incidence and progression. The pharmacokinetic concentration of the reporters and biochemical amplification of the disease signal are paramount to achieving high sensitivity and specificity in a diagnostic test. Here, a cancer diagnostic platform is built using one format of synthetic biomarkers: activity-based nanosensors carrying chemically stabilized DNA reporters that can be liberated by aberrant proteolytic signatures in the tumor microenvironment. Synthetic DNA as a disease reporter affords multiplexing capability through its use as a barcode, allowing for the readout of multiple proteolytic signatures at once. DNA reporters released into the urine are detected using CRISPR nucleases via hybridization with CRISPR RNAs, which in turn produce a fluorescent or colorimetric signal upon enzyme activation. In this protocol, DNA-barcoded, activity-based nanosensors are constructed and their application is exemplified in a preclinical mouse model of metastatic colorectal cancer. This system is highly modifiable according to disease biology and generates multiple disease signals simultaneously, affording a comprehensive understanding of the disease characteristics through a minimally invasive process requiring only nanosensor administration, urine collection, and a paper test which enables point-of-care diagnostics.

This protocol describes a CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test that enables point-of-care cancer diagnostics through the ex vivo analysis of tumor-associated protease activities.