这项研究部分得到了美国国家癌症研究所（斯旺森生物技术中心）的科赫研究所支持资助 P30-CA14051、美国国家环境健康科学研究所的核心中心资助 P30-ES002109、科赫研究所的大理石癌症纳米医学中心、科赫研究所前沿研究计划通过 Kathy 和 Curt 大理石癌症研究基金， 以及弗吉尼亚和D.K.路德维希癌症研究基金。A.E.V.H. 由 NIH 资助的博士前培训奖学金 （T32GM130546） 提供支持。S.N.B. 是霍华德休斯医学研究所的研究员。L.H. 得到了美国国家癌症研究所的 K99/R00 独立之路奖和波士顿大学的启动资金的支持。

所有动物研究均由作者所在机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。需要标准的动物护理设施，包括饲养室、无菌罩、麻醉和伦理终点安乐死，才能正确进行这些实验。所有实验均按照机构和国家指南进行，并由该机构的兽医人员监督。用于实验的雌性BALB / c小鼠是从商业来源获得的（参见 材料表），在研究开始时的年龄范围为6至8周。 补充表1中提供了定制合成的DNA、crRNA、基于FRET的肽底物探针和传感器肽的序列。
1. 蛋白酶激活肽底物选择
<ol><li>根据先前发表的报告13，从健康肺或具有肿瘤结节的肺组织中收集和制备组织样本。<ol><li>使用组织解离管在预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（200mg组织/ mL PBS）中匀浆组织，以将组织自动解离成单细胞悬浮液。</li>
		<li>离心组织在4°C下以6,000× g 匀浆5分钟。 将上清液保留在新管中。</li>
		<li>在4°C下以14,000× g 离心上清液25分钟。</li>
		<li>使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒测量蛋白质浓度（参见 材料表）。</li>
		<li>向样品中加入 PBS 以制备 0.33 mg/mL 溶液。</li>
	</ol></li>
	<li>按照以下步骤评估蛋白水解活性。<ol><li>在 384 孔板中，向每个孔中加入 5 μL、6 μM 基于 FRET 的肽底物探针。对于每个探针，一式三份地进行反应。 注意：基于FRET的肽底物探针包含一个短肽序列（6-8个氨基酸，设计为对靶蛋白酶或一组蛋白酶具有特异性），以荧光团和淬灭剂对终止。 补充表1 中描述了两个FRET探头作为示例。完整的探针库可以在Hao等人中找到。13.</li>
		<li>在室温下以180× g 离心孔板10秒，以确保探针位于板的底部。</li>
		<li>向每个孔中加入 25 μL 0.33 mg/mL 组织样品或 40 μM 重组蛋白酶 13 。 注意：组织样品或重组蛋白酶的最终浓度可能需要根据其内在的蛋白水解活性进行优化。例如，高度蛋白水解的组织（如肠道）可能需要更高的稀释因子，以便监测初始酶裂解。</li>
		<li>以180× g （室温）短暂离心孔板，以混合探针和组织裂解物。</li>
		<li>通过在37°C下每2分钟测量荧光1小时（λex：485nm;λem：535nm）来监测解裂，立即开始检测探针切割。 注意：对特定的荧光团和淬灭剂对使用适当的激发和发射波长。在本研究中，为FAM荧光团设置了参数（λex：485 nm和λem：535 nm）。</li>
		<li>要分析荧光测量数据，请使用 https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic 提供的 Python（参见 材料表）软件包进行酶动力学分析。此脚本使用前 8-10 个初始时间点的线性拟合斜率计算初始反应速度 （V0）。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 传感器配方和表征
<ol><li>合成DNA和蛋白酶活化肽（PAP）的偶联物。<ol><li>在室温下，将20-mer硫代磷酸化DNA报告基因与3'-DBCO基团（1.1当量，参见 材料表）与C末端半胱氨酸末端的叠氮化物末端PAP一起在室温下孵育>4小时。如果放置过夜，则在4°C下孵育。</li>
		<li>在配备生物分子理想色谱柱的高效液相色谱（HPLC）系统上纯化产品（参见材料表）。将HPLC梯度设置为从5%A缓冲液（0.05%TFA在H2O中）开始，保持等度20分钟，并在65分钟达到80%B缓冲液（0.05%TFA，99.95%乙腈），流速为0.3mLmin-1，并收集保留时间为~31分钟的偶联产物。</li>
		<li>使用α-氰基-4-羟基肉桂酸作为基质14，通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间 （MALDI-TOF） 质谱法验证纯化的偶联物（参见 材料表）。</li>
	</ol></li>
	<li>合成DNA编码的基于活性的纳米传感器。<ol><li>将 2 mg 多价 PEG（40 kDa，8 臂，参见 材料表）与马来酰亚胺反应性基团溶解在 1 mL 100 mM 磷酸盐缓冲液 （pH 7.0） 和过滤器（截止值：0.2 μm）中。</li>
		<li>将半胱氨酸终止的DNA-肽偶联物（2当量，参见 材料表）加入PEG中，并在室温下反应>4小时。如果放置过夜，则在4°C下孵育。</li>
		<li>在快速蛋白质液相色谱（FPLC）上使用市售的葡聚糖-琼脂糖复合基质柱使用尺寸排阻色谱除去未偶联的材料（参见 材料表）。在PBS中运行样品，并在260nm处监测DNA的吸光度，在280nm处监测肽的吸光度。</li>
		<li>根据制造商推荐的速度，用离心过滤管（MWCO = 10 kDa）浓缩合成的纳米传感器（参见 材料表）。</li>
		<li>使用ssDNA检测试剂盒（参见 材料表）和λex：485nm和λem：535nm的酶标仪定量DNA的浓度。将纳米传感器储存在4°C。</li>
	</ol></li>
	<li>表征基于DNA编码活性的纳米传感器。<ol><li>通过动态光散射 （DLS） 测量 DNA 编码纳米传感器的流体动力学粒径。 注：纳米传感器的预期尺寸范围为15-50纳米，平均尺寸为20-30纳米。如果需要有限的尺寸范围，FPLC（在步骤2.3中）可用于分离具有不同分子量的较窄级分。</li>
		<li>用离心过滤管（MWCO = 10 kDa）将纳米传感器浓缩至0.5mg / mL（通过DNA浓度），并将样品加载到安装在低温支架上的碳膜涂层铜网格上。使用低温透射电子显微镜（200 kV，放大倍率10,000-60,000）观察形态14。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 传感器注射和尿液收集
<ol><li>收集尿液进行基线测量。<ol><li>将鼠标放入以96孔板为底的定制壳室（参见 补充图1）中。</li>
		<li>束缚鼠标并在膀胱上轻轻按压，以将任何剩余的尿液排到板上。</li>
		<li>将小鼠更换到正常外壳后，将收集的尿液（~100-200μL）从96孔板移液到1.5mL管中。</li>
	</ol></li>
	<li>建立临床前小鼠肿瘤模型。<ol><li>通过静脉注射表达荧光素酶的MC26-Fluc细胞系（100k细胞/小鼠）接种6至8周龄的BALB / c雌性小鼠（参见 材料表）。每周使用 体内 荧光成像系统监测肿瘤进展。 注意：发光信号指示的可见肿瘤负荷大约发生在注射该特定细胞系的第 2 周。在肿瘤进展过程中定期仔细检查荷瘤动物。</li>
	</ol></li>
	<li>在肿瘤植入后的不同时间点注射纳米传感器。<ol><li>在无菌PBS中通过DNA条形码制备含有浓度为1nmol的纳米传感器的注射溶液（最大体积为200μL）。</li>
		<li>将PBS中的200μL传感器溶液静脉注射到每只实验小鼠中。</li>
	</ol></li>
	<li>如步骤1.1-1.3所述，在传感器注射后1小时从健康对照和荷瘤小鼠收集尿液样本。 注意：新鲜尿液样本可以直接进行DNA条形码分析，也可以立即在冰上冷冻。</li>
</ol>4. DNA条形码的CRISPR检测：基于荧光
<ol><li>使用新鲜的尿液样本或在冰上解冻冷冻样本。在室温下以800× g 离心尿液样品5分钟。</li>
	<li>将 补充表2中的试剂混合，最后加入Cas12a酶（见 材料表），并通过上下移液轻轻混合反应。将反应在37°C孵育30分钟。</li>
	<li>如 补充表3所示，使用步骤2的产物一式三份运行报告反应。最后加入步骤2的反应，并快速送至酶标仪。</li>
	<li>通过在37°C下每2分钟测量荧光3小时（λex：485nm和λem：535nm）来检测LbaCas12a活化，以监测DNA报告基因的切割动力学。</li>
	<li>要分析荧光测量数据，请利用 https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic 提供的 Python 包进行酶动力学分析。此脚本使用前 8-10 个初始时间点的线性拟合斜率计算初始反应速度 （V0）。</li>
</ol>5. DNA条形码的CRISPR检测：纸质
<ol><li>在室温下以800× g 离心尿液样品5分钟。 注意：同时运行尿液样本进行基于荧光和纸张的CRISPR检测。</li>
	<li>合并 附表2中的试剂。在37°C孵育30分钟。 注意：该孵育步骤与基于荧光的CRISPR检测相同。</li>
	<li>使用FAM-生物素标记的DNA报告基因在纸条上进行侧向层析测定（参见 材料表）。使用步骤2的产物将 补充表4 中的试剂合并在96孔板中。用铝箔覆盖并在37°C下孵育1小时。 注意：根据上述基于荧光的CRISPR检测测定中的实时动力学监测选择最佳孵育时间。</li>
	<li>向 96 孔板的新鲜孔中加入 80 μL PBS。将步骤 3 中的 20 μL 样品加入该孔中。</li>
	<li>将一个侧流纸条放在每个孔中，等待液体到达条带顶部（<5分钟）。在纸条上查找对照和/或样品条的外观。</li>
	<li>拍摄侧流带的照片并使用 ImageJ 量化条带强度。</li>
</ol>

用于癌症诊断的 CRISPR-Cas 合成尿液生物标志物测试

<ol>
	<li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring.">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li><li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities.">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li><li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology.">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li><li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care.">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+new+dimensions.">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biomarkers:+a+twenty-first+century+path+to+early+cancer+detection.">Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection.</a> Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).</li><li>Kirkpatrick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+detection+of+lung+cancer+in+mice+via+noninvasive+pulmonary+protease+profiling.">Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling.</a> Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).</li><li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers.">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease.">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+quantum+dots.">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics.">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics.">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li><li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing.">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216 (2021).</li><li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice.">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li></ol>

S.N.B.、L.H. 和 R.T.Z. 在与本作品内容相关的专利申请中被列为发明人。S.N.B. 持有 Glympse Bio、Satellite Bio、Lisata Therapeutics、Port Therapeutics、Intergalactic Therapeutics、Matrisome Bio 的股权，并且是 Vertex 的董事;为Moderna提供咨询，并获得强生公司（Johnson & Johnson）、Revitope和Owlstone公司赞助的研究资金。

这里介绍的是一个高度可定制的平台，用于多路复用癌症检测，使用便携式尿液检测，使用微创注射传感器评估与疾病相关的蛋白水解活性。当被肿瘤蛋白酶激活时，肽底物裂解 通过 释放到尿液中的 DNA 条形码进行扩增。尿液样本中的合成DNA报告基因可以通过使用荧光检测或简单的纸质检测的二次CRISPR-Cas介导的酶扩增来读出。DNA条形码是一种有吸引力的标记合成生物标志物的方法，可提?...

尽管在鉴定脱落蛋白和 DNA 等肿瘤生物标志物方面付出了巨大努力，但癌症诊断领域仍因其在循环中的低丰度或快速降解而备受关注1。作为一种补充策略，选择性地响应疾病特征以产生放大信号的生物工程合成生物标志物代表了实现准确和可及诊断的新途径2,3。为了帮助检测，这些合成生物标志物利用肿瘤依赖性激活机制（如酶扩增）来生产具有改进信噪比的分析物4。本文利用一类癌症相关酶蛋白酶来激活可注射的纳米级传感器，以释放可从生物体液（如血液或尿液）中检测到的疾病报告基因5,6。鉴于肿瘤的异质性，开发一组蛋白酶激活的传感器可以进行多分析物测试，将不同的蛋白酶切割事件组合成一个“疾病特征”，以更特异性、多重的方式评估癌症的发病率和进展。
已经开发了蛋白酶激活的合成生物标志物，其包含偶联到惰性载体表面的肽底物7。当在体内注射时，这些肽被带到肿瘤中，然后肿瘤蛋白酶的酶裂解将报告基因释放到血液或尿液中进行检测。使用蛋白酶激活的合成生物标志物进行多重检测时，混合物中的每种合成生物标志物都必须使用唯一的分子条形码进行标记。为此，已经开发了各种方法，包括质量条形码和配体编码报告基因8,9,10。与这些可能仅限于几种不同信号可能性的多重方法相反，DNA条形码根据人类疾病状态的高度复杂性和异质性提供了更多的组合。为了扩大合成生物标志物的多重性，传感器通过用独特的DNA序列标记每个报告基因来对传感器进行条形码编码，以便通过CRISPR-Cas核酸酶进行检测，以放大离体生物流体信号。这些单链 DNA （ssDNA） 条形码旨在与互补的 CRISPR 向导 RNA （crRNA） 结合，激活 CRISPR-Cas12a11 的靶向触发的侧支核酸酶活性。这种核酸酶活性可用于切割通过荧光动力学或使用纸条检测到的报告基因 DNA 链。
除了通过蛋白酶（体内）和 CRISPR-Cas（离体）进行分子扩增外，蛋白酶激活的合成生物标志物的另一个关键设计特征涉及利用纳米材料药代动力学来增加生物流体中的诊断信号浓度10。一种方法是使用纳米颗粒载体来增加表面共轭肽底物的循环时间。选择聚乙二醇（PEG）树枝状聚合物作为具有相对较小的流体动力学直径和多价的纳米载体，以增加向肿瘤的递送。虽然 PEG 载体足够小以促进肿瘤递送，但其尺寸大于肾小球滤过屏障的 ~5 nm 尺寸截止值，因此只有裂解的肽底物才能清除到尿液中，利用肾脏的大小过滤12。在该协议中，概述了在临床前小鼠模型中合成和应用基于 DNA 条形码活性的纳米传感器的多步骤工作流程，重点介绍了 CRISPR-Cas 介导的多分析物合成尿液生物标志物测试的设置，该小组已采用该测试对多种癌症类型小鼠模型中的疾病状态进行分类 13.由于多功能设计原理，纳米传感器的所有三个功能组件——纳米载体（PEG聚合物）、刺激响应模块（蛋白酶激活底物）和生物流体报告基因（DNA条形码）——都可以根据特定应用需求精确互换，通过定制靶标和释放特异性来实现模块化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x NEB Buffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6002SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3&#8217;-DBCO group</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column</td>
			<td>&#160;Agilent</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td></td>
			<td>Various volumes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic transmission electron microscopy</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>cyroTEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine terminated DNA-peptide conjugates</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &#181;M</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental animals</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td>BALB/cAnNTac</td>
			<td>6&#8211;8&#8201;weeks of age</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>MGHD 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization&#8211;time of flight (MALDI&#8211;TOF) mass spectrometry&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex MALDI&#8211;TOF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC26-Fluc cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python, Version 3.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.python.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O11492</td>
			<td>ssDNA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA FAM-T10-Quencher and&#160; FAM-T10-Biotin reporter substrates</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td>For FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite Pro M200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas-mediated multianalyte synthetic urine biomarker test for portable diagnostics

为开发精确诊断创建合成生物标志物，可以通过超越传统生物流体测量的途径检测疾病。合成生物标志物通常利用在生物流体中提供可读信号的报告基因来反映疾病发病和进展过程中局部疾病微环境中的生化变化。报告基因的药代动力学浓度和疾病信号的生化扩增对于在诊断测试中实现高灵敏度和特异性至关重要。在这里，使用一种形式的合成生物标志物构建了一个癌症诊断平台：基于活性的纳米传感器携带化学稳定的DNA报告基因，可以通过肿瘤微环境中异常的蛋白水解特征释放出来。合成DNA作为疾病报告基因，通过将其用作条形码提供多重检测能力，允许一次读取多个蛋白水解特征。通过与CRISPR RNA杂交，使用CRISPR核酸酶检测释放到尿液中的DNA报告基因，CRISPR RNA在酶激活时产生荧光或比色信号。在该协议中，构建了DNA条形码，基于活性的纳米传感器，并在转移性结直肠癌的临床前小鼠模型中举例说明了它们的应用。该系统可根据疾病生物学进行高度修改，并同时产生多种疾病信号，通过微创过程提供对疾病特征的全面了解，只需纳米传感器给药、尿液收集和纸质测试即可实现即时诊断。

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

作者聚焦：用于疾病检测和成像的工程分子工具

CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物检测用于便携式诊断

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

提名蛋白酶激活肽底物 为了设计能够反映组织蛋白水解活性变化的传感器，首先使用肽探针库13 表征组织中的蛋白酶活性（图1）。通过将组织样本与设计用于检测底物切割的FRET探针相结合，新鲜和冷冻的组织样品可以提供有关肿瘤微环境蛋白水解活性的大量信息。将具有 FAM 荧光基团和 CPQ-2 淬灭剂的 FRET探针库与组织样品一起孵育。通过荧...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics at JoVE.com

该协议描述了一种CRISPR-Cas介导的多分析物合成尿液生物标志物测试，该测试通过对肿瘤相关蛋白酶活性的离体分析来实现即时癌症诊断。

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

心脏实验室正在设计分子和细胞工具，以精确跟踪和控制疾病生物学。我们使用有关病变组织的特殊信息来为异质性疾病的响应性检测、成像和治疗工具的设计提供信息。生物流体为疾病检测和评估提供了便利的机会，但这些机会往往受到相关分析物数量少的限制。因此，该领域的大部分都在寻求放大疾病相关信号的策略，以提高诊断测试的灵敏度，如BCR和表面等离子体共振。我们的方法不是依赖循环中的内源性疾病生物标志物，而是使用合成生物标志物来报告从注射的纳米传感器释放时的疾病活动。我们的合成生物标志物是化学稳定的DNA条形码，可以同时检测多种疾病微环境信号，并使用相应的条形码进行识别。

crispr-cas-mediated-multianalyte-synthetic-urine-biomarker-test-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

606 次观看.  Boston University. 心脏实验室正在设计分子和细胞工具，以精确跟踪和控制疾病生物学。我们使用有关病变组织的特殊信息来为异质性疾病的响应性检测、成像和治疗工具的设计提供信息。生物流体为疾病检测和评估提供了便利的机会，但这些机会往往受到相关分析物数量少的限制。因此，该领域的大部分都在寻求放大疾病相关信号的策略，以提高诊断测试的灵敏度，如BCR和表面等离子?...