Bu çalışma kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü'nden (Swanson Biyoteknoloji Merkezi) P30-CA14051 numaralı Koch Enstitüsü Destek Hibesi, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nden P30-ES002109 Çekirdek Merkez Hibesi, Koch Enstitüsü'nün Kanser Nanotıp Mermer Merkezi, Kathy ve Curt Marble Kanser Araştırma Fonu aracılığıyla Koch Enstitüsü Sınır Araştırma Programı, ve Virginia ve D. K. Ludwig Kanser Araştırmaları Fonu. A.E.V.H., NIH tarafından finanse edilen bir doktora öncesi eğitim bursu (T32GM130546) tarafından desteklenmektedir. S.N.B. Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacısıdır. L.H., Ulusal Kanser Enstitüsü'nden K99/R00 Bağımsızlığa Giden Yol Ödülü ve Boston Üniversitesi'nden başlangıç fonu ile desteklenmektedir.

Tüm hayvan çalışmaları, yazarların kurumundaki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu deneyleri düzgün bir şekilde gerçekleştirmek için barınma odaları, steril davlumbazlar, anestezi ve etik son nokta ötenazi dahil olmak üzere standart hayvan bakım tesisleri gereklidir. Tüm deneyler kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak yürütülür ve kurumdaki veteriner hekim personeli tarafından denetlenir. Deneyler için kullanılan dişi BALB/c fareleri, ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu) ve çalışmanın başlangıcında yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişmektedir. Özel sentezlenmiş DNA, crRNA, FRET bazlı peptit substrat probları ve sensör peptitleri için diziler Ek Tablo 1'de verilmiştir.
1. Proteazla aktive olan peptit substrat seçimi
<ol><li>Daha önce yayınlanmış bir raporu takiben sağlıklı akciğer veya tümör nodülleri olan akciğer dokusundan doku örnekleri toplayın ve hazırlayın13.<ol><li>Dokuların tek hücreli süspansiyonlara otomatik ayrışması için doku ayrışma tüpleri ile önceden soğutulmuş fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) (200 mg doku / mL PBS) içinde dokuları homojenize edin.</li>
		<li>Santrifüj dokusu 6.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika homojenize olur. Süpernatanı yeni bir tüpte tutun.</li>
		<li>Süpernatanı 14.000 x g'da 4 °C'de 25 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Bikinkoninik asit (BCA) protein tahlil kitini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>0.33 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için numuneye PBS ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek proteolitik aktiviteyi değerlendirin.<ol><li>384 oyuklu bir plakada, her oyuğa 5 μL, 6 μM FRET bazlı peptit substrat probları ekleyin. Her prob için reaksiyonu üç kopya halinde gerçekleştirin. NOT: FRET bazlı peptit substrat probu, bir florofor ve söndürücü çifti ile sonlandırılmış kısa bir peptit dizisi (bir hedef proteaz veya proteaz grubuna spesifik olacak şekilde tasarlanmış 6-8 amino asit) içerir. Örnek olarak Ek Tablo 1'de iki FRET probu açıklanmıştır. Probların tam kütüphanesi Hao ve ark.'da bulunabilir.13.</li>
		<li>Probların plakanın dibinde olduğundan emin olmak için kuyu plakasını oda sıcaklığında 180 xg'de 10 saniye santrifüjleyin.</li>
		<li>Her oyuğa 25 μL 0.33 mg/mL doku örneği veya 40 μM rekombinant proteaz13 ekleyin. NOT: Doku örneğinin veya rekombinant proteazın nihai konsantrasyonunun, içsel proteolitik aktivitelerine göre optimize edilmesi gerekebilir. Örneğin, bağırsaklar gibi yüksek proteolitik dokular, ilk enzimatik bölünmenin izlenmesine izin vermek için daha yüksek seyreltme faktörleri gerektirebilir.</li>
		<li>Probları ve doku lizatlarını karıştırmak için kuyu plakasını 180 x g'da (oda sıcaklığında) kısaca santrifüjleyin.</li>
		<li>Bölünmeyi izlemek için 1 saat boyunca her 2 dakikada bir (λörn: 485 nm; λem: 535 nm) plaka okuyucu ile floresan ölçümü yaparak prob bölünmesini hemen algılamaya başlayın. NOT: Belirli florofor ve söndürücü çiftleri için uygun uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanın. Bu çalışmada, FAM floroforu için parametreler (λex: 485 nm ve λem: 535 nm) ayarlanmıştır.</li>
		<li>Floresan ölçüm verilerini analiz etmek için, https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic'da bulunan enzim kinetik analizi için Python (Malzeme Tablosuna bakınız) paketini kullanın. Bu komut dosyası, ilk 8-10 başlangıç zaman noktasının doğrusal uyumunun eğimini kullanarak ilk reaksiyon hızını(V 0) hesaplar.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sensör formülasyonu ve karakterizasyonu
<ol><li>DNA ve proteazla aktive olan peptit (PAP) konjugatını sentezleyin.<ol><li>20-mer fosforotiyoatlı DNA raportörlerini 3'-DBCO grubu ile (1.1 denk, bkz. Malzeme Tablosu) 100 mM fosfat tamponunda (pH 7.0) C-terminal sistein uçlu azid sonlu PAP'lar ile oda sıcaklığında >4 saat inkübe edin. Gece boyunca ayrılacaksanız, 4 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>Ürünü, biyomoleküller için ideal bir kolonla donatılmış yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) sisteminde saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu). HPLC gradyanını %5 A tamponundan (H2O'da%0,05 TFA) başlayacak şekilde ayarlayın, 20 dakika boyunca izokratik tutun ve 0,3 mL min-1 akış hızıyla 65 dakikada %80 B tamponuna (%0,05 TFA, %99,95 asetonitril) ulaşın ve eşlenik ürünü ~31 dk'da tutma süresiyle toplayın.</li>
		<li>Saflaştırılmış konjugatları, matris14 olarak α-siyano-4-hidroksisinnamik asit kullanarak matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi ile doğrulayın (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA kodlu aktivite tabanlı nanosensörleri sentezleyin.<ol><li>2 mg çok değerlikli PEG (40 kDa, 8 kol, Malzeme Tablosuna bakınız) maleimid-reaktif grupla 1 mL 100 mM fosfat tamponu (pH 7.0) ve filtre (kesme: 0.2 μm) içinde çözün.</li>
		<li>Sistein sonlu DNA-peptit konjugatlarını (2 ek., Malzeme Tablosuna bakınız) PEG'ye ekleyin ve oda sıcaklığında >4 saat reaksiyona sokun. Gece boyunca ayrılacaksanız, 4 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>Hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) üzerinde ticari olarak temin edilebilen bir dekstran-agaroz kompozit matris sütunu ile boyut dışlama kromatografisi kullanarak konjuge olmayan malzemeleri çıkarın (bkz. Numuneleri PBS'de çalıştırın ve DNA için 260 nm'de ve peptit için 280 nm'de absorbansı izleyin.</li>
		<li>Sentezlenen nanosensörleri, üreticinin tavsiye ettiği hıza göre santrifüj filtre tüpleriyle (MWCO = 10 kDa) konsantre edin (bkz.</li>
		<li>ssDNA test kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) ve λex: 485 nm ve λem: 535 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Nanosensörleri 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA kodlu aktivite tabanlı nanosensörleri karakterize edin.<ol><li>Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile DNA kodlu nanosensörlerin hidrodinamik parçacık boyutunu ölçün. NOT: Nanosensörlerin beklenen boyut aralığı 15-50 nm, ortalama boyutu 20-30 nm'dir. Sınırlı bir boyut aralığı isteniyorsa, farklı moleküler ağırlıklara sahip daha dar fraksiyonları izole etmek için FPLC (adım 2.3'te) kullanılabilir.</li>
		<li>Nanosensörleri santrifüj filtre tüpleri (MWCO = 10 kDa) ile 0,5 mg/mL'ye (DNA konsantrasyonuna göre) konsantre edin ve numuneleri bir kriyoholder üzerine monte edilmiş karbon film kaplı bakır ızgaraya yükleyin. Kriyojenik transmisyon elektron mikroskobu (200 kV, 10.000-60.000 büyütme)14 kullanarak morfolojiyi gözlemleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sensör enjeksiyonu ve idrar toplama
<ol><li>Temel ölçüm için idrar toplayın.<ol><li>Fareyi, taban olarak 96 oyuklu bir plaka bulunan özel bir muhafaza odasına (bkz. Ek Şekil 1) yerleştirin.</li>
		<li>Fareyi dizginleyin ve kalan idrarı plakaya boşaltmak için mesaneye hafif bir baskı uygulayın.</li>
		<li>Fareyi normal yuvaya yerleştirdikten sonra toplanan idrarı (~ 100-200 μL) 96 oyuklu plakadan 1.5 mL'lik bir tüpe pipetleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Klinik öncesi murin tümör modeli oluşturun.<ol><li>6 ila 8 haftalık BALB / c dişi fareleri, lusiferaz eksprese eden MC26-Fluc hücre hattı (100k hücre / fare) ile intravenöz enjeksiyonla aşılayın (bkz. Bir in vivo floresan görüntüleme sistemi kullanarak tümör ilerlemesini haftalık olarak izleyin. NOT: Lüminesan sinyalle gösterilen görünür tümör yükü, bu özel hücre hattının enjeksiyonunun yaklaşık 2. haftasında ortaya çıkar. Tümör ilerlemesi sırasında tümör taşıyan hayvanları düzenli olarak dikkatlice kontrol edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tümör implantasyonundan sonra nanosensörleri farklı zaman noktalarına enjekte edin.<ol><li>Steril PBS'de DNA barkodu ile 1 nmol konsantrasyonda nanosensörler içeren bir enjeksiyon çözeltisi (maksimum 200 μL hacim) hazırlayın.</li>
		<li>PBS'de 200 μL sensör solüsyonunu intravenöz olarak her deneysel fareye enjekte edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Adım 1.1-1.3'te açıklandığı gibi sensör enjeksiyonundan 1 saat sonra sağlıklı kontrol ve tümör taşıyan farelerden idrar örnekleri toplayın. NOT: Taze idrar örnekleri doğrudan DNA barkod analizine işlenebilir veya hemen buz üzerinde dondurulabilir.</li>
</ol>4. DNA barkodlarının CRISPR tespiti: floresan bazlı
<ol><li>Taze idrar örnekleri kullanın veya donmuş örnekleri buz üzerinde çözün. İdrar örneklerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Reaktifleri Ek Tablo 2'de birleştirin, en son Cas12a enzimini ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve reaksiyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Reaksiyonu 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Ek Tablo 3'te gösterildiği gibi, 2. adımın çarpımını kullanarak raportör reaksiyonunu üç kopya halinde çalıştırın. En son Adım 2'deki reaksiyonu ekleyin ve hızlı bir şekilde plaka okuyucuya getirin.</li>
	<li>DNA raportörünün bölünme kinetiğini izlemek için 3 saat boyunca her 2 dakikada bir (λex: 485 nm ve λem: 535 nm) bir plaka okuyucu ile floresansı ölçerek LbaCas12a aktivasyonunu tespit edin.</li>
	<li>Floresan ölçüm verilerini analiz etmek için, https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic'da bulunan enzim kinetik analizi için Python paketini kullanın. Bu komut dosyası, ilk 8-10 başlangıç zaman noktasının doğrusal uyumunun eğimini kullanarak ilk reaksiyon hızını(V 0) hesaplar.</li>
</ol>5. DNA barkodlarının CRISPR tespiti: kağıt tabanlı
<ol><li>İdrar örneklerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. NOT: Floresan bazlı ve kağıt bazlı CRISPR tespiti için idrar örneklerini paralel olarak çalıştırın.</li>
	<li>Reaktifleri Ek Tablo 2'de birleştirin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. NOT: Bu inkübasyon adımı, floresan tabanlı CRISPR tespiti ile aynıdır.</li>
	<li>Bir kağıt şerit üzerinde yanal akış tahlili için FAM-biotin etiketli DNA raportörünü kullanarak raportör reaksiyonunu çalıştırın (bkz. Ek Tablo 4'teki reaktifleri, 2. adımın ürününü kullanarak 96 oyuklu bir plakada birleştirin. Alüminyum folyo ile kaplayın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin. NOT: Yukarıda açıklanan floresan tabanlı CRISPR algılama testindeki gerçek zamanlı kinetik izlemeye göre en uygun inkübasyon süresini seçin.</li>
	<li>96 oyuklu bir plakanın taze bir kuyusuna 80 μL PBS ekleyin. 3. adımdan bu kuyucuğa 20 μL numune ekleyin.</li>
	<li>Her oyuğa bir yanal akışlı kağıt şerit yerleştirin ve sıvı şeridin tepesine ulaşana kadar bekleyin (<5 dakika). Kağıt şerit üzerinde kontrol ve/veya numune bantlarının görünümüne bakın.</li>
	<li>Yanal akış şeridinin fotoğrafını çekin ve ImageJ'yi kullanarak bant yoğunluğunu ölçün.</li>
</ol>

Kanser Teşhisi için CRISPR-Cas Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

<ol>
	<li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring.">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li><li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-based+diagnostics:+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities.">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li><li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology.">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li><li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care.">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+new+dimensions.">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biomarkers:+a+twenty-first+century+path+to+early+cancer+detection.">Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection.</a> Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).</li><li>Kirkpatrick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+detection+of+lung+cancer+in+mice+via+noninvasive+pulmonary+protease+profiling.">Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling.</a> Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).</li><li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers.">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li><li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease.">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+clearance+of+quantum+dots.">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics.">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li><li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics.">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li><li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5'-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing.">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216 (2021).</li><li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice.">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li></ol>

S.N.B., L.H. ve R.T.Z. bu çalışmanın içeriğiyle ilgili bir patent başvurusunda mucit olarak listelenmiştir. S.N.B., Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio'da hisse sahibidir ve Vertex'te yöneticidir; Moderna'ya danışmanlık yapıyor ve Johnson & Johnson, Revitope ve Owlstone'dan sponsorlu araştırma fonu alıyor.

Burada, minimal invaziv enjekte edilmiş bir sensör kullanarak hastalıkla ilişkili proteolitik aktiviteyi değerlendiren taşınabilir bir idrar testi ile çoğullanmış kanser tespiti için son derece özelleştirilebilir bir platform sunulmaktadır. Tümör proteazları tarafından aktive edildiğinde, peptit substrat bölünmesi, idrara DNA barkod salınımı yoluyla amplifiye edilir. Bir idrar örneğindeki sentetik DNA raportörleri, florometrik algılama veya basit bir kağıt tabanlı test kullanılar...

Dökülen proteinler ve DNA gibi tümör biyobelirteçlerini tanımlamaya yönelik önemli çabalara rağmen, kanser tanı alanı, dolaşımdaki düşük bollukları veya hızlı bozulmaları nedeniyle zorlanmıştır1. Tamamlayıcı bir strateji olarak, güçlendirilmiş sinyaller üretmek için hastalık özelliklerine seçici olarak yanıt veren biyomühendislik ürünü sentetik biyobelirteçler, doğru ve erişilebilir teşhise yönelik yeni yolları temsil eder 2,3. Algılamaya yardımcı olmak için, bu sentetik biyobelirteçler, geliştirilmiş sinyal-gürültü oranına sahip analitler üretmek için enzimatik amplifikasyon gibi tümöre bağlı aktivasyon mekanizmalarından yararlanır4. Burada, kanserle ilişkili bir enzim sınıfı olan proteazlar, kan veya idrar gibi biyosıvılardan tespit edilebilen hastalık raportörlerini serbest bırakmak için enjekte edilebilir nano ölçekli sensörleri etkinleştirmek için kullanılır 5,6. Tümör heterojenliği ışığında, proteazla aktive olan sensörlerden oluşan bir panel geliştirmek, kanser insidansını ve ilerlemesini daha spesifik, çoğullanmış bir şekilde değerlendirmek için farklı proteaz bölünme olaylarını bir 'hastalık imzası' halinde birleştiren multianalit testlerine izin verir.
İnert bir taşıyıcının7 yüzeyine konjuge edilmiş peptit substratlarını içeren proteazla aktive olan sentetik biyobelirteçler geliştirilmiştir. İn vivo enjekte edildiğinde, bu peptitler tümöre taşınır, bunun üzerine tümör proteazları tarafından enzimatik bölünme, rapor edicileri tespit için kana veya idrara bırakır. Proteazla aktive olan sentetik biyobelirteçlerle çoğullanmış algılama, bir kokteyl içindeki her sentetik biyobelirtecin benzersiz bir moleküler barkodla etiketlenmesini gerektirir. Bu amaçla, toplu barkodlar ve ligand kodlu raportörler 8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Birkaç farklı sinyal olasılığıyla sınırlı olabilen bu çoğullama yöntemlerinin aksine, DNA barkodlaması, insan hastalık durumlarının yüksek karmaşıklığına ve heterojenliğine uygun olarak çok daha fazla kombinasyon sağlar. Sentetik biyobelirteçlerin çoğulluğunu genişletmek için, sensörler, biyoakışkan sinyali ex vivo olarak yükseltmek için CRISPR-Cas nükleaz yoluyla tespit için her bir raporlayıcıyı benzersiz bir DNA dizisi ile etiketleyerek barkodlanır. Bu tek sarmallı DNA (ssDNA) barkodları, tamamlayıcı CRISPR kılavuz RNA'larına (crRNA'lar) bağlanacak ve CRISPR-Cas12a11'in hedefle tetiklenen kollateral nükleaz aktivitesini aktive edecek şekilde tasarlanmıştır. Bu nükleaz aktivitesi, floresan kinetiği veya kağıt şeritler kullanılarak tespit edilen bir muhabir DNA zincirini parçalamak için kullanılabilir.
Proteazlar (in vivo) ve CRISPR-Cas (ex vivo) yoluyla moleküler amplifikasyona ek olarak, proteazla aktive olan sentetik biyobelirteçlerin bir diğer önemli tasarım özelliği, biyosıvılardaki tanısal sinyal konsantrasyonunu artırmak için nanomalzeme farmakokinetiğinden yararlanmayı içerir10. Bir yaklaşım, yüzeyde konjuge peptit substratlarının dolaşım süresini artırmak için bir nanopartikül taşıyıcının kullanılmasıdır. Bir polietilen glikol (PEG) dendrimer, tümörlere iletimi artırmak için nispeten küçük hidrodinamik çapa ve çok değerliliğe sahip bir nanotaşıyıcı olarak seçilir. Tümör iletimini teşvik edecek kadar küçük olsa da, PEG taşıyıcısının boyutu, böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin ~ 5 nm boyutundaki kesiminden daha büyüktür, böylece böbrekler tarafından boyut filtrasyonundan yararlanarak sadece parçalanmış peptit substratları idrara temizlenebilir12. Bu protokolde, klinik öncesi bir fare modelinde DNA barkodlu aktivite tabanlı nanosensörlerin sentezi ve uygulanması için çok adımlı iş akışı ana hatlarıyla belirtilmekte ve bu grup tarafından çoklu kanser türlerinin fare modellerinde hastalık durumunu sınıflandırmak için kullanılan CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testinin kurulumu vurgulanmaktadır13. Çok yönlü tasarım prensibi sayesinde, nanosensörün üç işlevsel bileşeninin tümü - nanotaşıyıcı (PEG polimeri), uyaranlara duyarlı modül (proteazla aktive edilmiş substrat) ve biyoakışkan raportör (DNA barkodu) - uygulamaya özel ihtiyaçlara göre hassas bir şekilde değiştirilebilir ve hedef ve serbest bırakma özgüllüklerini uyarlayarak modülerliğe izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x NEB Buffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6002SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3&#8217;-DBCO group</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column</td>
			<td>&#160;Agilent</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA fast protein liquid chromatography (FPLC)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa)</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td></td>
			<td>Various volumes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNAs&#160;</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>See Supplementary Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic transmission electron microscopy</td>
			<td>JEM-2100F</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>cyroTEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine terminated DNA-peptide conjugates</td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Custom peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering (DLS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &#181;M</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental animals</td>
			<td>Taconic Biosciences</td>
			<td>BALB/cAnNTac</td>
			<td>6&#8211;8&#8201;weeks of age</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>MGHD 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix-assisted laser desorption/ionization&#8211;time of flight (MALDI&#8211;TOF) mass spectrometry&#160;</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex MALDI&#8211;TOF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC26-Fluc cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group</td>
			<td>JenKem</td>
			<td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python, Version 3.9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.python.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>O11492</td>
			<td>ssDNA assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ssDNA FAM-T10-Quencher and&#160; FAM-T10-Biotin reporter substrates</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Custom DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9909-44</td>
			<td>For FPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite Pro M200 plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr-cas-mediated multianalyte synthetic urine biomarker test for portable diagnostics

Hassas teşhislerin geliştirilmesi için sentetik biyobelirteçlerin oluşturulması, geleneksel biyoakışkan ölçümleri için kullanılanların ötesindeki yolaklar aracılığıyla hastalığın tespit edilmesini sağlamıştır. Sentetik biyobelirteçler genellikle, hastalık insidansı ve ilerlemesi sırasında yerel hastalık mikroçevresindeki biyokimyasal değişiklikleri yansıtmak için biyosıvıda okunabilir sinyaller sağlayan raporlayıcılardan yararlanır. Raportörlerin farmakokinetik konsantrasyonu ve hastalık sinyalinin biyokimyasal amplifikasyonu, bir tanı testinde yüksek duyarlılık ve özgüllük elde etmek için çok önemlidir. Burada, bir sentetik biyobelirteç formatı kullanılarak bir kanser teşhis platformu oluşturulmuştur: tümör mikroçevresindeki anormal proteolitik imzalarla serbest bırakılabilen, kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA raportörleri taşıyan aktivite tabanlı nanosensörler. Bir hastalık raportörü olarak sentetik DNA, barkod olarak kullanılmasıyla çoğullama yeteneği sağlar ve aynı anda birden fazla proteolitik imzanın okunmasına izin verir. İdrara salınan DNA raportörleri, CRISPR RNA'ları ile hibridizasyon yoluyla CRISPR nükleazları kullanılarak tespit edilir ve bu da enzim aktivasyonu üzerine bir floresan veya kolorimetrik sinyal üretir. Bu protokolde, DNA barkodlu, aktivite tabanlı nanosensörler oluşturulur ve bunların uygulamaları, metastatik kolorektal kanserin klinik öncesi fare modelinde örneklendirilir. Bu sistem, hastalık biyolojisine göre oldukça değiştirilebilir ve aynı anda birden fazla hastalık sinyali üretir, bu da yalnızca nanosensör uygulaması, idrar toplama ve hasta başı teşhisi sağlayan bir kağıt testi gerektiren minimal invaziv bir süreçle hastalık özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.

Despite the significant effort to identify tumor biomarkers such as shed proteins and DNA, the cancer diagnostic field has been strained by their low abundance or rapid degradation in circulation1. As a complementary strategy, bioengineered synthetic biomarkers that selectively respond to disease features to generate amplified signals represent new avenues towards accurate and accessible diagnostics2,3. To aid detection, these synthetic biomarkers harness tumor-dependent activation mechanisms such as enzymatic amplification to produce analytes with improved signal-to-noise ratio4. Herein, a class of cancer-associated enzymes, proteases, are leveraged to activate injectable nanoscale sensors to release disease reporters detectable from the biofluids such as blood or urine5,6. In light of tumor heterogeneity, developing a panel of protease-activated sensors allows for multianalyte tests that combine different protease cleavage events into a &#39;disease signature&#39; to assess cancer incidence and progression in a more specific, multiplexed manner.
Protease-activated synthetic biomarkers have been developed that comprise peptide substrates conjugated to the surface of an inert carrier7. When injected in vivo, these peptides are carried to the tumor whereupon enzymatic cleavage by tumor proteases release reporters into blood or urine for detection. Multiplexed detection with protease-activated synthetic biomarkers requires each synthetic biomarker within a cocktail to be labeled with a unique molecular barcode. To this end, various approaches have been developed, including mass barcodes and ligand-encoded reporters8,9,10. As opposed to these methods of multiplexing which may be limited to a few different signal possibilities, DNA barcoding affords many more combinations in accordance with the high complexity and heterogeneity of human disease states. To expand the multiplexity of synthetic biomarkers, the sensors are barcoded by labeling each reporter with a unique DNA sequence for detection via CRISPR-Cas nuclease to amplify the biofluidic signal ex vivo. These single-stranded DNA (ssDNA) barcodes are designed to bind to complementary CRISPR guide RNAs (crRNAs), activating the target-triggered collateral nuclease activity of CRISPR-Cas12a11. This nuclease activity can be employed to cleave a reporter DNA strand detected through fluorescence kinetics or using paper strips.
In addition to molecular amplification via proteases (in vivo) and CRISPR-Cas (ex vivo), another key design feature of protease-activated synthetic biomarkers involves harnessing nanomaterial pharmacokinetics to increase diagnostic signal concentration in biofluids10. One approach is the use of a nanoparticle carrier to increase the circulation time of surface-conjugated peptide substrates. A polyethylene glycol (PEG) dendrimer is selected as a nanocarrier with relatively small hydrodynamic diameter and multivalency to increase delivery to tumors. While small enough to promote tumor delivery, the size of the PEG carrier is larger than the ~5 nm size cut-off of the kidney glomerular filtration barrier so that only cleaved peptide substrates can be cleared into the urine, taking advantage of size filtration by the kidneys12. In this protocol, the multiple-step workflow is outlined for the synthesis and application of DNA-barcoded activity-based nanosensors in a preclinical murine model, highlighting the setup of the CRISPR-Cas-mediated, multianalyte synthetic urine biomarker test, which has been employed by this group to classify disease status in murine models of multiple cancer types13. Owing to the versatile design principle, all three functional components of the nanosensor - the nanocarrier (PEG polymer), the stimuli-responsive module (protease-activated substrate), and the biofluidic reporter (DNA barcode) - can be precisely interchanged according to application-specific needs, allowing for modularity by tailoring the target and release specificities.

Yazar Spotlight: Hastalık Tespiti ve Görüntüleme için Mühendislik Moleküler Araçları

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

The Heart Lab is engineering molecular and cellular tools to precisely track and control disease biology. We use special information about diseased tissues to inform the design of responsive detection, imaging, and treatment tools for heterogeneous disorders. Biofluids present a convenient opportunity for disease detection and assessment, but these are often limited by low quantities of relevant analytes.As a result, much of the field is pursuing strategies to amplify disease associated signals to improve the sensitivity of diagnostic tests, like BCR and surface plasma on resonance. Rather than relying on endogenous disease biomarkers in circulation, our approach uses synthetic biomarkers to report disease activity when released from injected nanosensors. Our synthetic biomarkers are chemically stabilized DNA barcodes, which allow for multiple disease microenvironment signals to be detected at once, and identified using the corresponding barcode.

Proteazla aktive olan peptit substratlarının isimlendirilmesi Dokunun proteolitik aktivitesindeki değişiklikleri yansıtacak sensörler tasarlamak için, dokudaki proteaz aktivitesi ilk olarak bir peptit probları13 kütüphanesi kullanılarak karakterize edilir (Şekil 1). Taze ve donmuş doku örnekleri, doku örneklerini substrat bölünmesini tespit etmek için tasarlanmış FRET probları ile birleştirerek tümör mikroçevresinin proteol...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics at JoVE.com

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Kalp Laboratuvarı, hastalık biyolojisini hassas bir şekilde izlemek ve kontrol etmek için moleküler ve hücresel araçlar tasarlıyor. Heterojen bozukluklar için duyarlı tespit, görüntüleme ve tedavi araçlarının tasarımını bilgilendirmek için hastalıklı dokular hakkında özel bilgiler kullanıyoruz. Biyoakışkanlar, hastalık tespiti ve değerlendirmesi için uygun bir fırsat sunar, ancak bunlar genellikle düşük miktarlarda ilgili analitlerle sınırlıdır.Sonuç olarak, alanın çoğu, BCR ve rezonans üzerindeki yüzey plazması gibi tanı testlerinin duyarlılığını artırmak için hastalıkla ilişkili sinyalleri yükseltmek için stratejiler izlemektedir. Dolaşımdaki endojen hastalık biyobelirteçlerine güvenmek yerine, yaklaşımımız enjekte edilen nanosensörlerden salındığında hastalık aktivitesini bildirmek için sentetik biyobelirteçler kullanır. Sentetik biyobelirteçlerimiz, birden fazla hastalık mikroçevre sinyalinin aynı anda tespit edilmesini ve ilgili barkod kullanılarak tanımlanmasını sağlayan kimyasal olarak stabilize edilmiş DNA barkodlarıdır.

crispr-cas-mediated-multianalyte-synthetic-urine-biomarker-test-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

628 Görüntüleme.  Boston University. Kalp Laboratuvarı, hastalık biyolojisini hassas bir şekilde izlemek ve kontrol etmek için moleküler ve hücresel araçlar tasarlıyor. Heterojen bozukluklar için duyarlı tespit, görüntüleme ve tedavi araçlarının tasarımını bilgilendirmek için hastalıklı dokular hakkında özel bilgiler kullanıyoruz. Biyoakışkanlar, hastalık tespiti ve değerlendirmesi için uygun bir fırsat sunar, ancak bunlar genellikle düşük miktarlarda ilgili analitlerle sınırlıdır.Son...